一种融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种融合蛋白及其制备方法与应用。所述融合蛋白包括GSDME突变蛋白和肿瘤细胞特异性穿膜肽；所述GSDME突变蛋白中将GSDME蛋白中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶识别的序列突变为基质金属蛋白酶识别的氨基酸序列提供对肿瘤的靶向作用；通过半胱氨酸突变为丙氨酸降低GSDME蛋白在体外的错误折叠率，增加其成药的可能性。构建了具有肿瘤靶向性和穿透性以及肿瘤微环境特异性激活的融合蛋白，为抗癌靶向药的开发提供了新的思路；能够直接将焦亡组件GSDME的N端送入肿瘤细胞内诱导焦亡并且通过激活机体自身免疫从而提高其他抗肿瘤免疫疗法的敏感性，扩大了现有抗肿瘤免疫疗法的效率和适用范围，具有重要意义。具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]GSDME基因，又名DFNA5，编码496个氨基酸，含有一个焦孔素gasdermin结构域，属于gasdermin家族成员之一。GSDME蛋白由两个不同功能的结构域组成，N端具有膜穿孔活性C端通过与N端的域
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域之间相互作用，维持其构象稳定和转变，进而发挥自抑制及调控细胞焦亡的生物学功能。
[0003]细胞焦亡是一种“燃烧式”伴随炎症反应的程序性细胞死亡，由炎症小体或LPS等激活炎症性含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)或颗粒酶(Granzyme)切割gasdermin，使其形成N端和C端结构域，N端自组装成桶装结构直接与膜脂结合诱发膜穿孔，破坏细胞内渗透压，导致细胞膨胀，释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，引起炎症反应；同时，伴随细胞因子白介素IL
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1和IL
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18的释放，导致进一步的炎症反应。在生理条件下，GSDME能够被Caspase
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3/Granzyme B切割激活，从而导致细胞凋亡向细胞焦亡转换。早在十几年前，研究表明，GSDME的启动子在多种肿瘤细胞中被甲基化，这一表观修饰抑制了其在肿瘤细胞中的表达；GSDME能抑制胃癌、黑色素瘤、结直肠癌等肿瘤细胞集落形成和增殖；GSDME水平的降低与乳腺癌死亡率上升有关。这些线索提示GSDME是一种肿瘤抑制因子。近年的随着GSDME在细胞焦亡中的作用被发现后，越来越多研究证实GSDME是一种有效的抑癌基因，但在大部分肿瘤组织中沉默表达或发生突变导致功能缺失，当激活肿瘤中的GSDME时，它可以将免疫系统无法识别的“冷”肿瘤转变为免疫系统可以控制的“热”肿瘤。
[0004]肿瘤有多种方法逃避免疫系统的攻击，而科学家们也通过癌症免疫疗法进行了反击，目前其中主要方法是使用免疫检查点抑制剂，另一种方法是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR
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T)。但是，并非所有肿瘤患者都能通过这些方法进行治疗，研究显示这些方法仅对少数癌症类型有效，大部分肿瘤都属于“冷”肿瘤，导致这些免疫疗法存在一定的局限性。GSDME是启动细胞焦亡和先天免疫调控的分子开关，选择融合蛋白的方法启动细胞焦亡，是因为与小分子药物相比，蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、原核或真核表达使生产方便，有利于大规模生产和临床应用。本专利技术根据GSDME的作用机制，使用融合表达的方式构建了肿瘤靶向激活细胞焦亡的蛋白质类药物系统，并使用一系列功能学实验验证了TRAP诱导焦亡的有效性。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面的目的，提供一种GSDME突变蛋白。
[0006]本专利技术第二方面的目的，提供本专利技术第一方面所述的GSDME突变蛋白的相关生物材料。
[0007]本专利技术第三方面的目的，提供一种融合蛋白。
[0008]本专利技术第四方面的目的，提供本专利技术第三方面所述的融合蛋白的相关生物材料。
[0009]本专利技术第五方面的目的，提供本专利技术第三方面所述的融合蛋白的制备方法。
[0010]本专利技术第六方面的目的，提供本专利技术第一方面所述GSDME突变蛋白或本专利技术第二方面所述相关生物材料或本专利技术第三方面所述的融合蛋白或本专利技术第四方面所述的相关生物材料的应用。
[0011]本专利技术第七方面的目的，提供一种产品。
[0012]本专利技术第八方面的目的，提供一种联合用药。
[0013]本专利技术所采取的技术方案是：
[0014]本专利技术的第一方面，提供一种GSDME突变蛋白，所述GSDME突变蛋白为在GSDME的基础上进行以下至少一种突变：
[0015]a)SEQ ID NO.1中的半胱氨酸突变为丙氨酸；和/或
[0016]b)SEQ ID NO.1中的半胱氨酸突变为其它氨基酸且与a)功能相同或相似；和/或
[0017]c)SEQ ID NO.1中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase3)识别的DMPDAAH氨基酸序列突变为基质金属蛋白酶(MMPs)识别的氨基酸序列。
[0018]在一些实施方式中，SEQ ID NO.1中具体为在C45、C159、C168、C180、C235、C331、C365、C371、C407、C408、C417、C482、C489的一个或多个半胱氨酸位置处的突变；优选为所有半胱氨酸突变为丙氨酸。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述MMPs选自MMP1、MMP2、MMP9和MMP11中的至少一种。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述GSDME突变蛋白的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所述，优选为SEQ ID NO.6。
[0021]本专利技术的第二方面，提供本专利技术第一方面所述的GSDME突变蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料为下述(A1)～(A8)中的任一种：
[0022](A1)编码所述GSDME突变蛋白的核酸分子；
[0023](A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；
[0024](A3)含有(A1)所述核酸分子的重组载体；
[0025](A4)含有(A2)所述表达盒的重组载体；
[0026](A5)含有(A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0027](A6)含有(A2)所述表达盒的重组微生物；
[0028](A7)含有(A3)所述重组载体的重组微生物；
[0029](A8)含有(A4)所述重组载体的重组微生物。
[0030]本专利技术的第三方面，提供一种融合蛋白，包括GSDME蛋白和肿瘤细胞特异性穿膜肽。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，所述GSDME蛋白为本专利技术第一方面所述的GSDME突变蛋白或SEQ ID NO.1所示的蛋白。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，所述肿瘤细胞特异性穿膜肽为蛋白多肽、单链可变区抗体以及纳米抗体。
[0033]在本专利技术的一些实施方式中，所述蛋白多肽为H16；所述单链可变区抗体Her2单链可变区4D5；所述纳米抗体Her2纳米抗体。
[0034]在本专利技术的一些实施方式中，所述肿瘤包括胰腺癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、肾癌、肺
癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌中的至少一种。
[0035]在本专利技术的一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列为a)或b)：
[0036]a)SEQ ID NO.3～4或SEQ ID NO.7～8任一项所示；
[0037]b)a)所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
[0038]在本专利技术的一些实施方式中，所述融本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GSDME突变蛋白，其特征在于，所述GSDME突变蛋白为在GSDME的基础上进行以下至少一种突变：a)SEQ ID NO.1中的半胱氨酸突变为丙氨酸；和/或b)SEQ ID NO.1中的半胱氨酸突变为其它氨基酸且与a)功能相同或相似；和/或c)SEQ ID NO.1中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶识别的DMPDAAH氨基酸序列突变为基质金属蛋白酶识别的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的GSDME突变蛋白，其特征在于，所述GSDME突变蛋白的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所述。3.权利要求1或2所述的GSDME突变蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料为下述(A1)～(A8)中的任一种：(A1)编码所述GSDME突变蛋白的核酸分子；(A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；(A3)含有(A1)所述核酸分子的重组载体；(A4)含有(A2)所述表达盒的重组载体；(A5)含有(A1)所述核酸分子的重组微生物；(A6)含有(A2)所述表达盒的重组微生物；(A7)含有(A3)所述重组载体的重组微生物；(A8)含有(A4)所述重组载体的重组微生物。4.一种融合蛋白，包括GSDME蛋白和肿瘤细胞特异性穿膜肽，所述GSDME蛋白为权利要求1～2任一项所述的GSDME突变蛋白或SEQ ID NO.1所示的蛋白。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞特异性穿膜肽为蛋白多肽、单链可变区抗体以及纳米抗体。6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾木圣，冯国开，李紫倩，杨杰，叶嘉聪，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：