一种抗虫蛋白hRI及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抗虫蛋白hRI及其编码基因和应用，所述抗虫蛋白hRI的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。所述基因序列如序列表中的序列2所示。上述的抗虫蛋白hRI和基因在提高植物抗虫性中的应用。本发明专利技术首次将hRI应用于植物抗虫研究，并取得很好的抗虫效果，转基因抗虫植物对害虫生长的抑制率（依据害虫体重计算）大于60%；与对照相比，转基因抗虫植物所受虫害非常轻微。虫害非常轻微。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫蛋白hRI及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种抗虫蛋白hRI及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]虫害造成农作物的产量和品质损失，严重影响农业生产的稳定与可持续发展。采用化学杀虫剂来控制虫害，在保护了农作物的同时，也带来了如农药残留、害虫抗性进化、杀灭天敌、污染环境等严重问题。利用转基因技术开发转基因抗虫作物，具有高效、低成本、环保等特点。
[0003]目前农业生产上的转基因抗虫植物上表达的抗虫基因主要为来自苏云金芽孢杆菌的δ
‑
内毒素(Bt毒蛋白)、蛋白酶/淀粉酶抑制(例如豇豆蛋白酶抑制剂CpTI、α
‑
淀粉酶抑制剂)、植物介导RNAi等。
[0004]在植物抗虫基因工程领域，目前生产上可用的抗虫基因种类非常有限。长期使用这些抗虫基因，必然会造成害虫的抗性进化，使转基因植物抗虫性降低或丧失，从而使用农业生产重新面临虫害威胁。随着上述转基因抗虫植物的推广和种植年限的延长，害虫的抗性进化问题越来越突出，亟需寻求新的抗虫基因或手段。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是提供一种抗虫蛋白hRI及其编码基因和应用，以解决现有转基因植物优良抗虫基因较单一、昆虫抗性进化的问题，从而为植物抗虫基因工程提供新的抗虫基因资源。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种抗虫蛋白hRI，所述抗虫蛋白hRI的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
[0007]编码上述抗虫蛋白hRI的基因，所述基因序列如序列表中的序列2所示。
[0008]含有上述基因片段的重组载体。所述重组载体通过如下方法构建：将序列表中序列2所示的基因片段连接到pBIN438质粒上，从而构成植物表达载体pBIN438
‑
hRI。
[0009]含有上述重组载体的重组菌株，所述重组菌株为根癌农杆菌。
[0010]上述的抗虫蛋白hRI和基因在提高植物抗虫性中的应用。
[0011]将上述的基因片段导入目的植物中得到转基因植物，抗虫蛋白hRI在转基因植物中表达，从而使所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。
[0012]上述的基因片段是通过上述的重组载体导入目的植物中的。
[0013]所述抗虫是指抗棉铃虫。
[0014]所述目的植物为陆地棉或烟草。
[0015]本专利技术所用的抗虫蛋白hRI为人核糖核酸抑制因子(Human ribonuclease inhibitor，hRI)，与RNA的降解抑制有关。hRI与RNase1、牛RNase A等核糖核酸酶结合极为牢固(解离常数3.5
×
10
‑
14
M
‑
4.5
×
10
‑
14
M)。本专利技术首次将hRI应用于植物抗虫研究，并取得很好的抗虫效果，转基因抗虫植物对害虫生长的抑制率(依据害虫体重计算)大于60％；与
对照相比，转基因抗虫植物所受害虫危害非常轻微。
[0016]目前已经报道用于植物抗虫研究的降解酶类抑制剂基因都是针对淀粉、蛋白质；本专利技术的技术基于长期的实验室验证、分析，具有坚实的实验证据和较好的应用价值，能够作为现有抗虫基因的储备资源，用于植物抗虫基因工程。
附图说明
[0017]图1重组hRI对棉铃虫中肠RNA酶活性的抑制活性。(a)hRI对dsRNA1的保护效果(b)hRI对dsRNA2的保护效果；M：DNA Marker；1：dsRNA未处理组；2：dsRNA+hRI未处理组；3
‑
6：不同用量hRI实验组；7：RRI(商品化重组RNA抑制剂，Takara公司，2313Q)对照组；8：EGFP对照组。
[0018]图2pBIN438
‑
hRI载体构建示意图。
[0019]图3转hRI基因烟草植株的基因组DNA的PCR鉴定。数字编号是转基因植株，WT是野生型植株。
[0020]图4转hRI基因烟草植株的RT
‑
PCR鉴定。数字编号是转基因植株，WT是野生型植株。
[0021]图5 24h烟草叶片的被咬噬情况。hRI
‑
2、hRI
‑
11、hRI
‑
12是三个表达hRI的烟草植株，WT是未转基因野生型对照。
[0022]图6取食转hRI烟草叶片棉铃虫体重变化。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。本专利技术实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法进行，本领域技术人员可参照相关技术书籍实施，如：格林、萨姆布鲁克等著《分子克隆实验指南》第4版(2017)，等。
[0024]实施例1
[0025]核糖核酸酶抑制因子hRI蛋白的活性分析
[0026]采用RT
‑
PCR技术从人肺组织cDNA扩增得到hRI编码基因序列，所用引物序列为：
[0027]Hrif：5'
‑
CACTCTTCACCTCCACCA
‑
3'
[0028]hrir：5'
‑
CTGAGCGTTTCTCTTCAAACC
‑
3'
[0029]PCR反应性程序：预变性(95℃，3min)，35个扩增(95℃10s；52℃退火30s，72℃；72℃延伸90s)，以及再延伸(72℃，10min)。凝胶电泳，目的条带凝胶回收后，通过酶连克隆到pUCm
‑
T载体，经过转化、筛选及测序验验证。
[0030]使用TC克隆方法(参考中国专利技术专利：一种基因定向克隆用TC载体及其制备和使用方法，专利号CN201210436709.7)制备可以进行TC定向克隆的原核表达载体pET17b
‑
TC；经XcmI酶切回收酶切质粒载体片段。使用引物：
[0031]HRPepf:5'
‑
ATGAGCCTGGACATCCAGAGCCTGGACATCCAGTGTG
‑
3'
[0032]HRPepr:5'
‑
TCAGGAGATGACCCTCAGGGATGGCTTGTCCTTCTCCA
‑
3'
[0033]扩增pUCm
‑
T上的hRI基因序列，凝胶电泳回收后与pET
‑
17b
‑
TC大片段连接。经转化、筛选、鉴定后得到hRI基因原核表达质粒，随后导入BL21(DE3)pLysS大肠杆菌感受态。
[0034]使用His
‑
Tag技术进行了hRI蛋白分离与纯化：用IPTG诱导hRI蛋白表达，hRI蛋白表达产物经过SDS
‑
PAGE检查；将诱导菌体用10mL Tris
‑
HCl裂解液(含溶菌酶)重悬，4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗虫蛋白hRI，其特征在于，所述抗虫蛋白hRI的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。2.编码权利要求1所述抗虫蛋白hRI的基因，其特征在于，所述基因序列如序列表中的序列2所示。3.含有权利要求2所述基因片段的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体通过如下方法构建：将序列表中序列2所示的基因片段连接到pBIN438质粒上，从而构成植物表达载体pBIN438
‑
hRI。5.含有权利要求2或3所述重组载体的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为根癌农杆菌。6.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀敏，李继刚，刘智，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：