一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法技术

本发明专利技术涉及一种HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法


[0001]本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法。

技术介绍

[0002]盐酸胍法辛缓释片是美国Shire制药公司研发的一种选择性α
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2A肾上腺素受体激动剂，于2009年9月2日获美国FDA批准上市，是首个获准用于治疗ADHD的α
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2A受体激动剂。FDA已批准盐酸胍法辛缓释片(Guanfacine，Intuniv)用于6～17岁儿童和青少年注意力缺陷与多动障碍(ADHD)的治疗。有文献表明盐酸胍法辛缓释片可直接作用于大脑前额皮质区域的额叶前皮质受体，而突触后α
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2A受体受到刺激后可增强记忆、减少干扰、提高注意力、增强抑制行为能力和控制冲动行为。
[0003]目前，国内文献有报道采用液质联用测定胍法辛含量的方法。例如，文献LC
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MS/MS法测定Beagle犬血浆中胍法辛的质量浓度(韩博，沈阳药科大学学报，2014)，中公开了Beagle犬血浆中胍法辛的检测方法，但是血浆样品的预处理中采取液液萃取的方法，步骤繁琐，耗时长，且血浆用量较多为500μL，不适用于大批量分析样品。并且在检测方法中使用非氘代内标盐酸格拉司琼作内标，无法控制分析物与内标的基质效应相同，可能使样品检测结果与真实值有差距。
[0004]为满足临床大批量样品分析评价药物生物等效性的需求，需开发更简单、可靠、快速、高通量的样品预处理方法以及用于检测人血浆中胍法辛浓度的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种样本量少、重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小，提取回收率较高的检测人血浆中胍法辛浓度的方法。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法，它包括以下步骤：(1)人血浆样品,前处理；(2)液相色谱
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质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为乙腈；所述流动相B为2～20mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中胍法辛浓度的测定。其中，人血浆样品采用蛋白质沉淀法进行前处理，沉淀剂为甲醇；色谱柱为ACE C18
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PFP；所述梯度洗脱过程如下：在0
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2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至40:60；在2.5
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2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至90:10；在2.8
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3.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为90:10；在3.8
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4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在4.0
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5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在梯度洗脱过程中，强洗针液为甲醇
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乙腈
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异丙醇混合溶液。具体的梯度洗脱过程如表1：
[0008]表1：胍法辛液相色谱梯度
[0009][0010]对于本专利技术而言，采用其他梯度洗脱过程，其分离效果不佳，定量上限样品后的残留样品中分析物容易产生残留，影响高浓度样品后的样品测定的准确度，出现残留的可能原因是初始水相比例比较高，导致残留物累积，在出峰位置被洗脱出来。
[0011]本专利技术采用HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛时，在一种优选方案中，在梯度洗脱过程中，弱洗针液为甲醇
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水混合溶液，为了更好的实施本专利技术，在弱洗针液中甲醇和水的体积比为1～9:9～1，在不影响本专利技术效果的情况下，在进一步优选方案中，在弱洗针液中甲醇和水的体积比为1:1。在实验过程中发现，采用常用的强洗针液，例如，甲醇、乙腈、甲醇
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乙腈、甲醇
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乙醇、甲醇
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异丙醇以及甲醇
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乙腈
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异丙醇作为强洗针液，除了甲醇
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乙腈
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异丙醇之外，其他溶剂作为强洗针液均出现高浓度样品后的较高分析物残留，影响高浓度样品之后的样品的准确测定。对于本专利技术而言，强洗针液为甲醇
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乙腈
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异丙醇混合溶液，可有效去除残留，使得检测结果准确和可靠，在一种优选方案中，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1～2:2～3:1，在不影响本专利技术效果的情况下，在进一步优选方案中，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1:2:1。
[0012]本专利技术采用HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛时，在一种优选方案中，流动相B为10mM甲酸铵水溶液。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；在不影响本专利技术效果的情况下，在一种优选方案中，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸，即流动相B为0.1％甲酸
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10mM甲酸铵水溶液。
[0013]本专利技术采用HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛时，采用ACE 3C18
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PFP作为色谱柱，进一步地，该色谱柱的长度为75mm，直径为4.6mm，填料粒径为3μm，即ACE3C18
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PFP(75
×
4.6mm,3μm)。
[0014]在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本专利技术采用上述提及的流动相进行梯度洗脱，以ACE C18
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PFP作为色谱柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，且重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小。而采用其他类似的色谱柱，例如，色谱柱为Aglient ZORBAX XDB
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Phenyl，分离效果较差，出现色谱峰响应变低，峰展宽且出现拖尾现象。
[0015]在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本专利技术采用HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛时，采用胍法辛
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13C
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15N3作为内标，以同位素内标做内标物，同位素内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中胍法辛浓度的重现性、准确度均较好。
[0016]在步骤(1)中，本专利技术对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，采用甲醇作为沉淀剂。采用蛋白沉淀法进行前处理人血浆样品，可以避免繁琐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)人血浆样品,前处理；(2)液相色谱
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质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为乙腈；所述流动相B为2～20mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中胍法辛浓度的测定；其中，人血浆样品采用蛋白质沉淀法进行前处理，沉淀剂为甲醇；色谱柱为ACE C18
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PFP；所述梯度洗脱过程如下：在0
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2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至40:60；在2.5
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2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至90:10；在2.8
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3.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为90:10；在3.8
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4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在4.0
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5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在梯度洗脱过程中，强洗针液为甲醇
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乙腈
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异丙醇混合溶液。2.根据权利要求1所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法，其特征在于，在梯度洗脱过程中，强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1～2:2～3:1，优选地，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1:2:1；弱洗针液为甲醇
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水混合溶液，优选地，在弱洗针液中甲醇和水的体积比为1～9:9～1，更优选地，在弱洗针液中甲醇和水的体积比为1:1。3.根据权利要求1所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法，其特征在于，所述流动相B为10mM甲酸铵水溶液；优选地，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；更优选地，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸。4.根据权利要求1所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法，其特征在于，液相色谱条件包括：所述色谱柱的长度为75mm，直径为4.6mm，填料粒径为3μm；柱温为30～45℃，优选为40℃；流速为0.5～1.0mL/min，优选为0.8mL/min。5.根据权利要求1所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中胍法辛的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤雨晴，李艳静，王金莹，王华娟，
申请(专利权)人：南京海纳制药有限公司南京一诺医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：