一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法技术

本发明专利技术公开了一种2019

【技术实现步骤摘要】
一种2019
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nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法


[0001]本专利技术涉及疫苗制备领域中，一种2019
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nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法。

技术介绍

[0002]冠状病毒是一个大型病毒家族，严重程度从感冒到重症疾病不等，如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)。新型冠状病毒(SARS
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COV
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2)感染后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。较严重病例中，可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
[0003]新冠病毒肺炎(COVID
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19)尚无特效药物或治疗方法，新冠肺炎疫苗成为公众最期待的防御武器。为了提升疫苗研发的成功率，科研攻关组布局了病毒灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和减毒流感病毒载体疫苗五条疫苗研发技术路线。除病毒灭活疫苗外，抗原种类选择和表达策略成为疫苗成功的核心要素。
[0004]新型冠状病毒表面蛋白(S)参与宿主细胞膜受体(ACE
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2)结合及膜融合功能，成为疫苗开发的关键靶点。表面蛋白(S)全长1273个氨基酸，分子量超过130Kd，限制重组新冠疫苗产能。表面蛋白S1亚基或受体结合区(RBD)成为疫苗开发的理想抗原，截短后单体形成聚体和纯化工艺成为抗原生产中的瓶颈。1)形成聚体：天然表面蛋白(S)以三聚体形式存在，截短的S1亚基，氮端结构域(NTD)和受体结合区(RBD)均以单体形式存在，无法形成抗原之间空间表位。智飞生物的串联表达和三叶草生物的Trimer
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Tag技术有效解决该问题。2)纯化工艺：S1亚基，氮端结构域(NTD)和受体结合区(RBD)无标签，纯化工艺开发困难。传统生产工艺采用离子交换，分子筛和疏水层析等非特异纯化方法，回收率低下。

技术实现思路

[0005]为了解决新冠疫苗开发上述瓶颈问题，专利技术人采用Fc融合技术制备新型冠状病毒疫苗抗原成分。
[0006]本专利技术首先提供了一种新型冠状病毒受体结合区二聚体的制备方法，所述方法包括：将SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区二聚体；
[0007]所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因为下述(a1)
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(a4)中的任一种：
[0008](a1)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0009](a2)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
[0010](a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA分子杂交且编码所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的DNA分子；
[0011](a4)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上
或者80％以上同一性且编码所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的DNA分子。
[0012]上述方法中，SEQ ID No.1的第1
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19位所示为信号肽，第20
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242位所示为新型冠状病毒受体结合区(RBD)，第243
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469位所示为Fc标签。
[0013]同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0014]所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6
×
SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
SSC，0.1％SDS和1
×
SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0015]本专利技术还提供了一种新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的制备方法，所述方法包括：将所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区融合蛋白。
[0016]上述方法中，所述宿主细胞可为真核细胞。
[0017]所述真核细胞可为动物细胞，如HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞或昆虫细胞等。在本专利技术的一个实施例中，所述动物细胞为Expi293F细胞。
[0018]上述方法中，所述重组表达载体为将所述编码基因插入表达载体得到的能够表达所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的载体。
[0019]所述表达载体可为pCGS3载体。
[0020]所述重组表达载体可为pCGS3
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M1或pCGS3
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M2；
[0021]所述pCGS3
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M1为将pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2所示的DNA分子得到的重组载体；
[0022]所述pCGS3
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M2为将pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.3所示的DNA分子得到的重组载体。
[0023]所述融合蛋白可利用Protein A亲合层析纯化。
[0024]SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白，也属于本专利技术的保护范围。
[0025]所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因，也属于本专利技术的保护范围。
[0026]含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系，也属于本专利技术的保护范围。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒受体结合区二聚体的制备方法，包括：将SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区二聚体；所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因为下述(a1)
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(a4)中的任一种：(a1)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；(a2)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA分子杂交且编码所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的DNA分子；(a4)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的DNA分子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为真核细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述编码基因插入表达载体得到的能够表达所述新...

【专利技术属性】
技术研发人员：安文琪，王斌，张静静，邢体坤，宋路萍，杨振苹，
申请(专利权)人：华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：