以CD28和4-1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以CD28和4

【技术实现步骤摘要】
以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肝细胞癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，目前针对肝细胞癌的治疗方法比如化疗、放疗、肝切除术、消融疗法、靶向疗法如索拉菲尼、抗体疗法如免疫检查点抑制剂、血管内皮生长因子受体抑制剂，这些治疗方法都不能取得良好的治疗效果。
[0003]嵌合抗原受体T细胞疗法是新型的免疫细胞治疗方法，具有特异性且高效的杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞的功能。CD276又称为B7
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H3，是属于B7家族的一类跨膜蛋白。CD276在多种癌症中高表达包括肺腺癌、脑胶质瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌，在正常组织中几乎不表达。靶向CD276的单克隆抗体在多种肿瘤模型中介导肿瘤的有效清除。CD276在肝细胞癌高表达并且与肝癌的进展和肿瘤病人的不良预后相关。这提示，CD276可以作为一个治疗肝细胞癌的有潜力靶点。
[0004]目前，靶向CD276的CAR
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T细胞对肝细胞癌和其它高表达CD276的恶性肿瘤的杀伤活性研究有限。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及制备方法和应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0007]本专利技术的内容之一在于提供一种以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，所述以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0008]优选地，所述以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0009]优选地，所述以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体包括从氨基端到羧基端依次为靶向CD276的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号转导区、P2A和荧光蛋白EGFP的氨基酸序列。
[0010]进一步优选地，所述靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
[0011]更进一步优选地，所述靶向CD276的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
[0012]进一步优选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
[0013]更进一步优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:5所示的氨基
酸序列。
[0014]更进一步优选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
[0015]当然，胞外铰链区还可以使用CD28铰链区、IgG1铰链区或IgG4铰链区。
[0016]进一步优选地，所述跨膜区为CD8α跨膜区。
[0017]更进一步优选地，所述CD8α跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0018]更进一步优选地，所述CD8α跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0019]当然，跨膜区还可以使用CD4跨膜区、CD28跨膜区、CD3ζ跨膜区或ICOS的跨膜区。
[0020]进一步优选地，所述共刺激结构域由CD28胞内区、4
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1BB胞内区依次串联构成。
[0021]更进一步优选地，所述CD28胞内区的的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码该CD28胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0022]更进一步优选地，所述4
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1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码该4
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1BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0023]进一步优选地，所述信号转导区为CD3ζ胞内区；该CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0024]更进一步优选地，CD3ζ胞内区的编码基因包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
[0025]进一步优选地，所述P2A氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；编码P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
[0026]进一步优选地，所述荧光蛋白EGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；编码荧光蛋白EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
[0027]本专利技术的内容之二在于提供一种靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞，包括上述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体；该以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0028]进一步地，靶向CD276的嵌合抗原受体CAR
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CD276
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28BBζ的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0029]本专利技术的内容之三在于提供一种靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0030]1)将以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体CAR
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CD276
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28BBζ的编码基因插入到pWPXLd载体中，得到pWPXLd
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CAR
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CD276
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28BBζ重组质粒；
[0031]其中，靶向CD276的嵌合抗原受体CAR
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CD276
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28BBζ的编码基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO:2；
[0032]2)将所述pWPXLd
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CAR
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CD276
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28BBζ重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
[0033]3)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞。
[0034]进一步地，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为
HEK293T细胞。
[0035]进一步地，步骤3)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
[0036]更进一步地，所述人源外周血单个核细胞来源于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，该靶向CD276的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述靶向CD276的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，该靶向CD276的嵌合抗原受体包括从氨基端到羧基端依次连接的靶向CD276的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号转导区、P2A和荧光蛋白EGFP的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD276的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码该靶向CD276的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。5.根据权利要求3所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区为CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码该CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。6.根据权利要求3所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD8α跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码该CD8α跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。7.根据权利要求3所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激结构域由CD28胞内区、4
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1BB胞内区依次串联构成；其中：所述CD28胞内区的的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码该CD28胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述4
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1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码该4
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1BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。8.根据权利要求3所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导区为CD3ζ胞内区，该CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；编码该CD3ζ胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。9.根据权利要求3所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体，其特征在于，所述P2A氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；编码P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；所述荧光蛋白EGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；编码荧光蛋白EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。10.一种靶向CD276的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括权利要求1～9中任意一项所述的以CD28和4
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1BB为共刺激结构域的靶向CD276的嵌合抗原受体。11.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，曹国政，
申请(专利权)人：中国科学院深圳理工大学筹，
类型：发明
国别省市：