一种嵌合抗原受体（CAR）及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用。本发明专利技术提供了一种ROR1特异性嵌合抗原受体，包括信号肽、抗人ROR1scFv、铰链区、跨膜区、4

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域和生物
，具体提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤因其具有难治愈性、高死亡率、低愈后临床表现，而成为威胁人类健康的最严重的疾病之一，为此研究人员先后尝试了多种肿瘤治疗手段和技术，包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、基因治疗等等，但是截至目前仍未找到行之有效的治疗手段。随着生物技术和免疫学研究的深入，肿瘤免疫治疗和抗肿瘤抗体受到业内的重视，自上世纪80年代以来，全球范围内已有上百种抗体并批准用于肿瘤治疗，以免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞为代表的新一代免疫治疗技术也得到广泛重视，并用于治疗多种恶性肿瘤。
[0003]受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase
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like orphan receptor1，ROR1)是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)家族成员之一，与生长因子受体的酪氨酸激酶结构域具有很高的同源性。人ROR1分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区包括一个免疫球蛋白样结构域(immunoglobulin
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like domain，Ig
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like)、两个富含半胱氨酸卷曲的结构域(cysteine
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rich domain or frizzled，CRD or FZD)和一个kringle(KNG)结构域；胞内区含有一个酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain，TKD)、两个富含丝氨酸/苏氨酸结构域(serine/threonines
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rich domain，Ser/ThrD)和一个富含脯氨酸富集结构域(proline
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rich domain，PRD)。大量研究显示ROR1在促进肿瘤的生长和转移、诱导肿瘤细胞耐药和抑制细胞凋亡等方面起到了关键性的作用，尤其是ROR1正常组织中低水平表达，而高表达于多种恶性肿瘤或组织中，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等等。ROR1在肿瘤组织中具有高度识别性，基于这种特性，使得ROR1成为一种新型的肿瘤特异性标志物和抗肿瘤靶点。
[0004]针对ROR1靶点，已经开发出了多种肿瘤免疫疗法，包括：(1)单克隆抗体，是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，该类抗体灵敏度高，特异性强，交叉反应少，制备的成本低，是目前应用最为广泛的抗体药物。目前研究人员针对ROR1靶点开发了多种单克隆抗体，如JP2021522162A、WO2021202863A1、EP3842072A1、CN112384533A等公开了相应的抗ROR1单克隆抗体；(2)双特异性抗体，该类抗体含有2种特异性抗原结合位点，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，进一步增强抗体治疗的靶向性，EP2984107A1公开了针对ROR1和CD3靶点的双特异性抗体，可有效抵抗白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤；(3)抗体偶联药物(antibody
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drug conjugate，ADC)，是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，这种组合药物既具有生物分子的靶向性，又具有化学药较强的肿瘤杀伤能力，为了降低毒副作用，往往要求生物分子具有较高的特异性，对于连接生物分子和化学药物的连接子也需要进行精确设
计，以便充分发挥协同效应。针对ROR1的ADC药物也已经被报道，如Peyman等(Peyman B，Mozafar M，Ali Hakakian.Anti
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ROR1 scFv
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EndoG as a novel anti
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cancer therapeutic drug，APJCP，2017，19(1)：97
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102)将抗ROR1 ScFv与免疫毒素结合，可快速导致肿瘤细胞凋亡；(4)抗体衍射物，除单克隆抗体、双特性抗体等具有经典结构的抗体之外，研究人员还针对ROR1靶点开发出诸如单链片段可变抗体(scFv)、Fab抗体片段等抗体衍生物，均取得了一定的治疗效果。
[0005]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞，是近年来新兴的肿瘤免疫治疗技术，该技术将抗体分子的高度特异性和T细胞的高抗肿瘤活性相结合，展现出了对于肿瘤，尤其是难治愈性肿瘤、高复发性肿瘤良好的治疗效果，因而受到业内研究人员的重视。目前该技术已发展出多个代次，其中第一代CAR主要包括保外抗原结合域(如ScFv片段)和胞内信号域(如CD3ζ)，这种CAR及其CART细胞难以形成高度活化的T细胞，限制了肿瘤杀伤效应的发挥；第二代CAR是在第一代CAR的基础上，引入了位于胞内的共刺激因子(也称为协同刺激因子)，从而能够有效促进T细胞激活，充分发挥抗肿瘤作用，目前已有多个第二代CART细胞被批准上市，包括Kymriah(Novartis)、Yescarta(Gliead)、Tecartus(Gliead)等等；第三代CAR是引入了两个共刺激因子，以便形成更加有效的T细胞激活；第四代CAR是在T细胞中导入可分泌的细胞因子基因，如IL
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2、IFN
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γ等。
[0006]虽然CART技术得到了很大的发展，但是现有的CART细胞多以CD19为抗肿瘤靶点，该靶点多表达于淋巴瘤、白血病和骨髓瘤等血液肿瘤中，在临床上也取得了较好的疗效。然而，CD19同样表达于正常B细胞中，使得以其为靶点的CART细胞对正常细胞展开攻击，导致了严重不良反应的发生，甚至出现患者死亡的现象。如前所述，ROR1多表达于肿瘤细胞中，而正常细胞中鲜有表达，因此ROR1被认为是最适合构建CART细胞的靶点之一。
[0007]为此，研究人员先后开发出了多种以ROR1为靶点的CART细胞，其中以具有经典的第二代CAR结构的嵌合抗原受体居多，如CN105924533A、WO2016115559A1、WO2016187216A1、WO2019090110A1、WO2020160050A1等，上述专利申请多是针对ROR1靶点筛选并获得新型抗体结构，进而构建嵌合抗原受体，也有研究人员试图通过引入开关元件，控制CART细胞在体内的生物活性，防止严重副反应的发生，如CN107557337A公开了设置caspase9自杀基因安全开关，在同型二聚体AP1903的作用下使F36V
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FKBP发生二聚化，引起caspase9自杀基因的二聚化激活相关的调亡信号途径，诱导靶细胞的快速死亡；CN109837246A公开了敲除CART细胞中PD
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1基因，抑制肿瘤逃逸机制的启动。
[0008]尽管针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗人ROR1 scFv、铰链区、跨膜区、4
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1BB胞内域和CD3ζ胞内域，其中抗人ROR1 scFv包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。2.根据权利要求1所述的ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3.根据权利要求1所述的ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括人Fc结构域，所述人Fc结构域选自IgG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。4.根据权利要求1所述的ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张克礼，雷林均，
申请(专利权)人：北京创世客生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：