嵌合抗原受体（CAR）及其应用制造技术

本发明专利技术涉及嵌合抗原受体(CAR)及其应用。本发明专利技术提供了一种ROR1特异性嵌合抗原受体，包括信号肽、抗人ROR1 scFv、铰链区、跨膜区、4

【技术实现步骤摘要】
嵌合抗原受体(CAR)及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域和生物
，具体提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤因其具有难治愈性、高死亡率、低愈后临床表现，而成为威胁人类健康的最严重的疾病之一，为此研究人员先后尝试了多种肿瘤治疗手段和技术，包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、基因治疗等等，但是截至目前仍未找到行之有效的治疗手段。随着生物技术和免疫学研究的深入，肿瘤免疫治疗和抗肿瘤抗体受到业内的重视，自上世纪80年代以来，全球范围内已有上百种抗体并批准用于肿瘤治疗，以免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞为代表的新一代免疫治疗技术也得到广泛重视，并用于治疗多种恶性肿瘤。
[0003]受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase
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like orphan receptor1，ROR1)是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)家族成员之一，与生长因子受体的酪氨酸激酶结构域具有很高的同源性。人ROR1分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区包括一个免疫球蛋白样结构域(immunoglobulin
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like domain，Ig
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like)、两个富含半胱氨酸卷曲的结构域(cysteine
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rich domain or frizzled，CRD or FZD)和一个kringle(KNG)结构域；胞内区含有一个酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain，TKD)、两个富含丝氨酸/苏氨酸结构域(serine/threonines
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rich domain，Ser/ThrD)和一个富含脯氨酸富集结构域(proline
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rich domain，PRD)。大量研究显示ROR1在促进肿瘤的生长和转移、诱导肿瘤细胞耐药和抑制细胞凋亡等方面起到了关键性的作用，尤其是ROR1正常组织中低水平表达，而高表达于多种恶性肿瘤或组织中，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等等。ROR1在肿瘤组织中具有高度识别性，基于这种特性，使得ROR1成为一种新型的肿瘤特异性标志物和抗肿瘤靶点。
[0004]针对ROR1靶点，已经开发出了多种肿瘤免疫疗法，包括：(1)单克隆抗体，是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，该类抗体灵敏度高，特异性强，交叉反应少，制备的成本低，是目前应用最为广泛的抗体药物。目前研究人员针对ROR1靶点开发了多种单克隆抗体，如JP2021522162A、WO2021202863A1、EP3842072A1、CN112384533A等公开了相应的抗ROR1单克隆抗体；(2)双特异性抗体，该类抗体含有2种特异性抗原结合位点，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，进一步增强抗体治疗的靶向性，EP2984107A1公开了针对ROR1和CD3靶点的双特异性抗体，可有效抵抗白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤；(3)抗体偶联药物(antibody
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drug conjugate，ADC)，是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，这种组合药物既具有生物分子的靶向性，又具有化学药较强的肿瘤杀伤能力，为了降低毒副作用，往往要求生物分子具有较高的特异性，对于连接生物分子和化学药物的连接子也需要进行精确设
ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
[0010]进一步的，所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0011]本专利技术中所选用的抗人ROR1 scFv源自于申请人在前期实验中筛选并获得的新型抗体结构，除对目标抗原具有较高亲和力之外，还具有良好的热稳定性和pH稳定性，能够耐受肿瘤组织中的极端环境，对于实体肿瘤具有较高的抑制作用，适用于开发针对实体肿瘤的药物或免疫疗法。
[0012]进一步的，所述嵌合抗原受体还包括人Fc结构域，所述人Fc结构域选自IgG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0013]在现有技术中，Fc片段多用于和目标蛋白质结合形成融合蛋白，从而能够延长相关蛋白分子的体内半衰期，达到长效给药的目的，如将Fc片段与GLP
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2、IL
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2、IL
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15结合等等。而本专利技术中惊奇的发现，在嵌合抗原受体结构中，引入Fc片段后似乎能够提高抗原结合域与目标抗原的结合活性，同时抑制某些炎症因子的过度分泌，防止严重不良反应的发生。Fc片段包括多种类型，如IgG、IgM、IgA、IgD等，本专利技术中选用人体中最为常见、生理活性最强的人IgG1作为结合片段，以便有效降低排斥反应，同时延长CART细胞的作用时效。
[0014]进一步的，所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述4
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1BB胞内域氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；所述CD3ζ胞内域氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0015]提供了一种编码本专利技术中所述ROR1特异性嵌合抗原受体的核苷酸。
[0016]提供了一种重组载体，所述重组载体包括本专利技术所述的ROR1特异性嵌合抗原受体的核苷酸。
[0017]提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞本专利技术中所述的重组载体。
[0018]提供了一种ROR1特异性嵌合抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019]进一步的，所述肿瘤包括实体肿瘤和血液肿瘤。
[0020]进一步的，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、头颈癌、鼻咽癌、黑色素瘤。
[0021]有益效果
[0022]本专利技术中提供了一种新型ROR1特异性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体具有全新的抗原结合域，能够与目标抗原高度特异性结合，有效防止脱靶效益的发生。在嵌合抗原结构中引入Fc片段，可提高与目标抗原的亲和力和靶向性，同时抑制严重不良反应的发生，防止免疫因子风暴的出现，提供了较高的安全性。本专利技术中所述提供的嵌合抗原受体T细胞能够抑制多种实体肿瘤，促进抑癌因子分泌，激活体内免疫系统。本专利技术中所述的嵌合抗原受体T细胞能够在体内和体外实验中显著抑制肿瘤生长，发挥强大的抗肿瘤作用。
附图说明
[0023]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗人ROR1 scFv、铰链区、跨膜区、4
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1BB胞内域和CD3ζ胞内域，其中抗人ROR1 scFv包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。2.根据权利要求1所述的ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗人ROR1的scFv中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述抗人ROR1的scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3.根据权利要求1所述的ROR1特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括人Fc结构域，所述人Fc结构域选自IgG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。4.根据权利要求1所述的ROR...

【专利技术属性】
技术研发人员：张克礼，雷林均，
申请(专利权)人：北京创世客生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：