一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体（CAR）及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体(CAR)及其应用，具有如下结构：ROR1 scFv

【技术实现步骤摘要】
一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体(CAR)及其应用

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[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体(CAR)及其制备抗肿瘤药物的应用。

技术介绍
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[0002]目前，癌症已成为全球范围内致死率最高的疾病之一，但是现有的手术切除和放化疗等手段对早期肿瘤的治疗效果较好，却难以治疗中晚期患者，而且还会引起患者严重的不良反应，影响患者生活质量，增加患者及其家庭负担。近年来，随着肿瘤免疫治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cells，CART)疗法在抗癌方面取得了巨大的成功。这一疗法最初由Gross和他的同事于1989年提出，他们将抗体的抗原结合区scFv与CD3
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ζ链或FcεRIγ的胞内部分融合形成嵌合抗原受体。CAR的基本结构包括一个肿瘤相关抗原(tumor
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associated antigen,TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区(Hinge area)，一个跨膜区(Transmembrane region)和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine
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based activation motif,ITAM)。随后，研究人员为了提高CART的抗肿瘤能力，在Gross等人的研究基础上添加了共刺激信号分子，使得CART对肿瘤细胞的杀伤能力大幅度加强，并在血液肿瘤治疗方面取得了成功，2017年诺华公司的Kymiriah(CLT
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019和Kite制药(已被吉利德公司收购)的Yescarta(KTE
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C10)先后被美国FDA批准上市，2019年中国首款CAR
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T疗法阿基仑赛注射液(复星凯特)也被批准上市，掀起了针对嵌合抗原受体相关抗肿瘤药物的研究热潮。
[0003]早期的CART细胞多以CD19为治疗靶点，但是后续发现CD19不仅在肿瘤细胞中表达，在正常细胞中也有相对高的表达量，造成了CART细胞的“误判”而攻击正常细胞，诱发毒性反应。为此，研究人员开始尝试寻找新的治疗靶点，并且试图通过构建双特异性CART细胞降低脱靶现象的出现，及同时靶向两个抗肿瘤位点，提高识别特异性。
[0004]在这种理论指导下，大量新型抗肿瘤靶点被开发出来，其中受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1，ROR1)是最受瞩目的新型靶点之一。ROR1)是一种跨膜蛋白，属于受体酪氨酸激酶receptor tyrosine kinase，RTK)家族，酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)作为一组肿瘤特异性抗原。ROR1最初是在神经母细胞瘤株中发现并被命名为神经营养酪氨酸激酶受体相关蛋白，因为未发现其自然配体，所以被定义为孤儿受体。ROR 1参与细胞间信号交流，胞内信号传导等过程，调节细胞增殖、分化、转移和存活，ROR1在多种肿瘤中高表达，如白血病、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌等，但在正常产后组织中微量表达(Hojjat
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Farsangi M,Jeddi
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Tehrani M,Daneshmanesh AH,et al.Spontaneous Immunity Against the Receptor Tyrosine Kinase ROR1 in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia.PloS one.2015,10(11):e0142310.)。正是由于这种特性，ROR1成为了理想的抗肿瘤靶点和肿瘤诊断标志物。目前研究人员已经针对ROR1开发出来多种抗体或核酸抑制剂，用于治疗恶性肿瘤，但是有关ROR1的CART细胞却报道较少，如CA2973964A1、
WO2020160050A1、US20180265593A1、CN107557337A、WO2017127664A1等分别公开了ROR1抗体或嵌合抗原受体。涉及靶向ROR1的双特异性CART研究更加稀少，如CN109503716A公开了一种双特异性嵌合抗原受体，由信号肽，两个特异性抗原结合片段，膜外间隔区，跨膜区，胞内共刺激信号区组成，说明书中提及了第一个抗原可以选择ROR1，第一个抗原为CD38，但其实际提供的是BCMA&CD38嵌合抗原受体，并未研究包括ROR1靶点的双特异性CART。
[0005]可见，目前依然缺乏基于ROR1靶点可充分发挥抗肿瘤活性的CART细胞，尤其是如何开发包括ROR1靶点双特异CART细胞，如何选择能够产生协同效益的第二抗原，以便可提高肿瘤治疗靶向性、有效性和安全性，上述问题成为CART领域的研究难点和热点之一，本专利技术为解决上述技术问题，提供了一种新型的双特异性CART，为进一步开发相关抗肿瘤药物和疗法奠定了技术基础。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术中提供了一种双特异性嵌合抗原受体，包括第一抗原结合域和第二抗原结合域，所述第一抗原结合域靶向ROR1、BCMA、c
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Met、B7
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H6等目标抗原的是scFv，优选靶向ROR1 scFv；第一抗原结合域靶向CD19、CD20、CD33、CD7、CD3等目标抗原的是scFv，优选靶向CD7 scFv。
[0007]现有技术中已经报道了多种可作为嵌合抗原受体的目标靶点，包括但不限于ROR1、BCMA、c
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Met、B7
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H6、D19、CD20、CD33、CD7、CD3、CD123、PD
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1等，而如何选择双特异抗性的嵌合抗原受体目标靶点，却没有统一的标准和做法，甚至存在完全相反的教导和实验结果。为此，专利技术人经过大量实验筛选出了ROR1与CD7的组合，相对于其他双特异抗原组合，更能够有效识别和杀死白血病细胞。
[0008]在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括如下结构：ROR1 scFv
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CD7scFv
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H
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TM
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C
‑
CD3ζ其中
“‑”
为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列；ROR1 scFv包括如SEQ ID NO:1
‑
3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4
‑
6所示轻链CDR区；CD7
[0009]scFv包括如SEQ ID NO:7
‑
9所示重链CDR区和SEQ ID NO:10
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12所示轻链CDR区。
[0010]在某些实施方式中，所述ROR1 scFv包括如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括如下结构：ROR1 scFv
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CD7 scFv
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H
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TM
‑
C
‑
CD3ζ其中
“‑”
为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列；ROR1 scFv包括如SEQ ID NO:1
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3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4
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6所示轻链CDR区；CD7 scFv包括如SEQ ID NO:7
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9所示重链CDR区和SEQ ID NO:10
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12所示轻链CDR区。2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述ROR1scFv包括如SEQ ID NO:13所示重链可变区和SEQ ID NO:14所示轻链可变区。3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述C...

【专利技术属性】
技术研发人员：张克礼，雷林均，
申请(专利权)人：北京创世客生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：