用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，特别涉及用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针。与现有技术相比，本发明专利技术最终筛选出3对可以在甲基化敏感内切酶的辅助下对HOXB13基因甲基化水平进行判定的PCR效率高，特异性强，稳定性好的引物及对应探针序列，检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率；可以区分胃癌患者与健康人群，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。价和追踪以及预后评估。价和追踪以及预后评估。

【技术实现步骤摘要】
用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别涉及用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]胃癌的发病率在全世界范围内排在前列，由于胃癌在组织学和病因学上具有非常高的异质性，不同的治疗方案在临床上也产生各种各样的结果。因此如何准确的预测胃癌病人的生存和预后风险具有非常重要的临床意义。
[0003]胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显高，年龄在50岁以上，男女发病率比为2：1。胃癌可发生于位的任何部位，胃大弯、胃小弯、前后壁均可受累。早期胃癌预后较中晚期胃癌更好治疗，因此，诊断早期胃癌极为重要。目前早期胃癌的诊断主要依赖于内镜技术，但内镜技术属于侵入性检查，存在痛苦大、费用高等局限性，因此收筛查条件、人群、接受程度及就医成本的制约，尚无法成为大规模筛查的检测手段。

技术实现思路

[0004]针对以上述
技术介绍
的不足，本专利技术提供一种用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，解决了胃部肿瘤检测敏感度低，特异性差，避免膀胱镜检查引发的并发症的问题。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合，关键在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针；其中所述3对靶标特异引物的序列如下：
[0006]Seq ID NO.1：F
‑
TCGCCACCGACCCCACTAC，
[0007]Seq ID NO.2：R
‑
GCATTCTCCACGATTGAGCGCACAG；
[0008]Seq ID NO.3：F
‑
GAGATCTTGCGCCTCTTGTCCTTG，
[0009]Seq ID NO.4：R
‑
CAAGAAACGCATTCCGTACAGC；
[0010]Seq ID NO.5：F
‑
TTGACAGCAGGCATCAGCGTA，
[0011]Seq ID NO.6：R
‑
CCAAGGATATCGAAGGCTTGCTGG；
[0012]内参引物的序列如下：
[0013]Seq ID NO.7：F
‑
GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，
[0014]Seq ID NO.8：R
‑
ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；
[0015]所述特异性引物探针序列如下：
[0016]Seq ID NO.9：FAM
‑
ACAACCCGCAGAACCGAAGCTCC
‑
BHQ1，
[0017]Seq ID NO.10：FAM
‑
TTGTTAGCCGCATACTCCCGCTCC
‑
BHQ1；
[0018]Seq ID NO.11：FAM
‑
TCGCCCACTCCCCTCTGACC
‑
BHQ1；
[0019]内参引物探针序列如下：
[0020]Seq ID NO.12：VIC
‑
TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC
‑
BHQ1。
[0021]用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，关键在于：包括用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。
[0022]优选的，所述甲基化敏感内切酶体系包含HinP1I、HpaII、AciI。
[0023]试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用，关键在于筛查方法包括以下步骤：
[0024]S1.提取尿液中游离的cfDNA；
[0025]S2.将cfDNA与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；
[0026]S3.将孵育产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物及内参引物，进行多重PCR扩增；
[0027]S4.将扩增产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针、内参引物探针及内参引物，进行qPCR检测反应；
[0028]S5.根据3对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估膀胱癌风险；所述S5的评估方式为：
[0029]ΔCt＝3对引物特异扩增Ct值
‑
内参引物扩增Ct值；
[0030]ΔCt>4.89胃部肿瘤低风险；
[0031]ΔCt≤4.89胃部肿瘤高风险。
[0032]优选的，所述S1具体为：采用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒提取尿液中的cfDNA。
[0033]优选的，所述S2的孵育条件为：37℃孵育16h，在80℃酶失活20min。
[0034]优选的，所述S3的扩增程序为：98℃/45s，8个循环；98℃/15s，55℃/30s，72℃/30s，8个循环；72℃/1min，1个循环；4℃/hold。
[0035]根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15s，60℃/60s，45个循环。
[0036]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0037]1.本专利技术通过对比胃癌与癌变甲基化数据，筛选中国人群胃部肿瘤早期基因组超甲基化区域，并与白细胞基因组对应区域进行比对，发现HOXB13基因区域在胃部肿瘤中呈现超甲基化状态，而在白细胞中呈现低甲基化状态。针对该区域选择含有CCGC,CCGG,GCGC,ACGT,GCGG中至少两个位点的区间作为靶点设计若干对PCR引物，最终筛选出3对可以在甲基化敏感内切酶的辅助下对HOXB13基因甲基化水平进行判定的PCR效率高，特异性强，稳定性好的引物及对应探针序列；
[0038]2.利用甲基化敏感内切酶不能切割甲基化位点的特性，降解非肿瘤来源cfDNA，特异扩增肿瘤来源ctDNA极大提升检查灵敏度，克服了单个DNA甲基化信号低的问题，提高了检测的灵敏度及特异性；
[0039]3.基于DNA甲基化的检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率；可以区分胃癌患者与健康人群，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。
附图说明
[0040]图1为基于本专利技术的风险判定图；
[0041]图2为基于本专利技术的分类性能AUC曲线图；
[0042]图3为基于本专利技术的风险模型测试图。
具体实施方式
[0043]为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作详细说明。
[0044]实施例1用于膀胱癌早期筛查的试剂盒
[0045]包括Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒、包含HinP1I、HpaII、AciI的甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合，其特征在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针；其中所述3对靶标特异引物的序列如下：Seq ID NO.1：F
‑
TCGCCACCGACCCCACTAC，Seq ID NO.2：R
‑
GCATTCTCCACGATTGAGCGCACAG；Seq ID NO.3：F
‑
GAGATCTTGCGCCTCTTGTCCTTG，Seq ID NO.4：R
‑
CAAGAAACGCATTCCGTACAGC；Seq ID NO.5：F
‑
TTGACAGCAGGCATCAGCGTA，Seq ID NO.6：R
‑
CCAAGGATATCGAAGGCTTGCTGG；内参引物的序列如下：Seq ID NO.7：F
‑
GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，Seq ID NO.8：R
‑
ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；所述特异性引物探针序列如下：Seq ID NO.9：FAM
‑
ACAACCCGCAGAACCGAAGCTCC
‑
BHQ1，Seq ID NO.10：FAM
‑
TTGTTAGCCGCATACTCCCGCTCC
‑
BHQ1；Seq ID NO.11：FAM
‑
TCGCCCACTCCCCTCTGACC
‑
BHQ1；内参引物探针序列如下：Seq ID NO.12：VIC
‑
TACCCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春燕，张怡然，王冰，王昊昊，王东亮，周启明，
申请(专利权)人：杭州求臻医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：