一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物测序领域，特别涉及一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用；包括以下步骤：从样品细胞中获取单链核酸；采用片段化试剂对长链的单链核酸样本片段化；在片段化单链核酸的3'末端加上基团A；加入5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头和盐离子缓冲液，在室温条件下，3'修饰基团A的片段化单链核酸与5'端修饰基团B单链接头发生加成反应且连接在一起；加入单向延伸引物1、单向延伸引物2和单链延伸试剂，用于由单链核酸变成双链核酸；加入测序引物和PCR混合液进行扩增，扩增产物即为测序文库。本发明专利技术的方法不仅适用于RNA样品，还适用于ssDNA，操作步骤简单，具有时间短、成本低、效率高的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物测序领域，特别涉及一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用。
技术介绍
染色体的易位、倒位或缺失等是造成基因融合的常见发生机制。随着下一代测序技术(Next-generationsequencing，NGS)的发展，越来越多的研究显示，融合基因不仅存在于白血病等血液恶性肿瘤中，而且存在于甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌和肾癌等许多实体肿瘤中，其在肿瘤的发生过程中扮演着非常重要的角色，约占到肿瘤发生原因的20％。目前，针对融合基因的靶向药物和适应症正在不断的增加，例如，ALK抑制剂色瑞替尼(Ceritinib)可抑制非小细胞肺癌的进展；NTRK抑制剂拉罗替尼(larotrectinib)可用于治疗携带NTRK基因融合的晚期复发实体瘤患者。此外，融合基因还可以作为预后判断的的分子标志物，如BRC-ABL1的融合转录本的表达量可作为化疗预后评估的标志物。所以，通过对融合基因的精确检出，可以为患者的后续治疗提供更多的有效帮助。临床上，融合基因诊断的方法主要包括荧光原位杂交(FISH)和RT-PCR等方法。虽然这些方法灵敏度高，但通常只能检测单个融合基因，操作较复杂，造成诊断时间漫长，性价比较低。同时，这些方法无法识别复杂的结构重排或新的融合基因伴侣，会造成一些假阴性的结果。而基于DNA的测序技术可一次性高通量的检测多种基因的融合，包括未知融合基因，但这些融合可能出现在内含子区域，没有转录组测序数据，便无法判断融合产生的新基因是否表达或表达量的高低；基于RNA的测序技术，即转录组测序技术，可以明确表达的融合基因，能实现更准确的对融合基因的检测。目前市场上基于RNA测序的融合检测产品，主要是利用传统的RNA建库方法，步骤包括片段化、纯化、随机引物杂交，cDNA合成、第二条链合成、末端修复、纯化、磷酸化、加A、加接头、纯化、PCR富集和纯化，整个流程操作繁琐，所需试剂种类多、人力和物料成本较高，经过多次纯化易造成得率下降，且无法区分母链和子链。在高通量文库构建过程中利用基团化学修饰引入加成反应，此反应的反应条件温和，不需要任何酶的参与，室温下即可发生，可降低对实验条件的要求，减少器材等成本的投入；而且化学修饰碱基为已知序列，可以有效区分母链和子链；同时减少了建库步骤，缩短了操作时间和操作流程，且能稳定性的获得满足高通量测序的文库，适用于更准确的临床融合基因检测。为此，提出一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用，该方法不仅适用于RNA样品，还适用于ssDNA，操作步骤简单，具有时间短、成本低、效率高的优势。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，包括以下步骤：(1)从样品细胞中获取单链核酸；(2)采用片段化试剂对长链的单链核酸样本片段化；(3)在步骤(2)后加入含有基团A修饰的NTP试剂和末端转移酶，用于在片段化单链核酸的3'末端加上基团A；(4)在步骤(3)后加入5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头和盐离子缓冲液，在室温条件下，3'修饰基团A的片段化单链核酸与5'端修饰基团B单链接头发生加成反应且连接在一起；(5)在步骤(4)反应后的溶液中加入单向延伸引物1、单向延伸引物2和单链延伸试剂，用于由单链核酸变成双链核酸；(6)在步骤(5)纯化后的产物中加入测序引物和PCR混合液进行扩增，扩增产物即为测序文库。具体的，所述样品细胞的来源为人类的新鲜组织、全血、血浆、福尔马林石蜡包埋样本、粪便和尿液中的一种，所述单链核酸为总RNA、mRNA、ncRNA、lncRNA、cfRNA和ssDNA中的一种。具体的，所述片段化的时间为1分钟～20分钟，所述片段化试剂中的盐离子为Na+，Mg2+和Zn2+中的一种，所述片段化的温度为70℃～95℃。具体的，所述片段化的时间为5～10分钟，所述片段化的温度为85℃～95℃。具体的，所述NTP试剂为ATP、CTP、GTP、UTP和TTP中的一种，所述末端转移酶为TDT，所述盐离子缓冲液中的盐离子为Cu2+，所述Cu2+的添加量为0.1nM～1.0nM，所述基团A为叠氮基团，所述基团B为二苯并环辛炔，所述5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头序列长度为10～50bp，所述5'被基团B修饰且含有分子标签UMI互补序列的单链接头序列由5'修饰随机碱基N、分子标签UMI互补序列以及已知序列A三个部分组成。具体的，所述NTP试剂为ATP，所述5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头序列长度为25～35bp，所述5'被基团B修饰且含有分子标签UMI互补序列的单链接头序列为5'-N*-UMI-已知序列A，其中，所述*为DIBO修饰，所述5'修饰随机碱基N为A碱基对、T碱基对、C碱基对、G碱基对中的一个，所述分子标签UMI互补序列4～12个随机碱基对，所述已知序列A为5～30个已知碱基对。具体的，所述已知序列A包括5'-AGATCGGAAGAGCGTCGTGT-3'(SEQIDNO.1)的核苷酸序列。具体的，所述单向延伸引物1是与含有分子标签UMI的单链接头的已知序列A部分互补的的特异性引物，所述单向延伸引物1的长度为5～60nt，所述单向延伸引物1的序号包括5'-AATGATACGGCGACCACACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQIDNO.2)核苷酸序列，所述单向延伸引物2的序号包括5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCNNNNNNNNNGTGACTGGAGGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGG-3'(SEQIDNO.3)核苷酸序列。具体的，所述单向延伸引物1中的NNNNNNNN为样本标签序列1，所述3'端含有3个G碱基，所述单向延伸引物2中的NNNNNNNN为样本标签序列2，所述单链延伸试剂为MMLV酶。一种单链核酸分子高通量测序文库的应用，采用前面所述的方法构建测序文库，对所述测序文库进行测序，所述测序文库适用于Illumina测序平台、Roche测序平台、TermoFisher测序平台、BGI测序平台和MGI测序平台。优选的，本专利技术涉及的测序接头序列适用于Illumina测序平台。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，通过基团化学修饰引入加成反应，此反应的反应条件温和，不需要任何酶的参与，室温下即可发生，降低了对实验条件的要求，减少了器材等成本的投入，具有低成本的特点；(2)本专利技术中的化学修饰碱基为已知序列，可以有效区分母链和子链；(3)本专利技术在扩增前加入分子标签UMI，能够区分不同的核酸模板，有效减少假阳性的比率，提高对低频变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从样品细胞中获取单链核酸；/n(2)采用片段化试剂对长链的单链核酸样本片段化；/n(3)在步骤(2)后加入含有基团A修饰的NTP试剂和末端转移酶，用于在片段化单链核酸的3'末端加上基团A；/n(4)在步骤(3)后加入5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头和盐离子缓冲液，在室温条件下，3'修饰基团A的片段化单链核酸与5'端修饰基团B单链接头发生加成反应且连接在一起；/n(5)在步骤(4)反应后的溶液中加入单向延伸引物1、单向延伸引物2和单链延伸试剂，用于由单链核酸变成双链核酸；/n(6)在步骤(5)纯化后的产物中加入测序引物和PCR混合液进行扩增，扩增产物即为测序文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从样品细胞中获取单链核酸；
(2)采用片段化试剂对长链的单链核酸样本片段化；
(3)在步骤(2)后加入含有基团A修饰的NTP试剂和末端转移酶，用于在片段化单链核酸的3'末端加上基团A；
(4)在步骤(3)后加入5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头和盐离子缓冲液，在室温条件下，3'修饰基团A的片段化单链核酸与5'端修饰基团B单链接头发生加成反应且连接在一起；
(5)在步骤(4)反应后的溶液中加入单向延伸引物1、单向延伸引物2和单链延伸试剂，用于由单链核酸变成双链核酸；
(6)在步骤(5)纯化后的产物中加入测序引物和PCR混合液进行扩增，扩增产物即为测序文库。


2.根据权利要求1所述的一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述样品细胞的来源为人类的新鲜组织、全血、血浆、福尔马林石蜡包埋样本、粪便和尿液中的一种，所述单链核酸为总RNA、mRNA、ncRNA、lncRNA、cfRNA和ssDNA中的一种。


3.根据权利要求1所述的一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述片段化的时间为1分钟～20分钟，所述片段化试剂中的盐离子为Na+，Mg2+和Zn2+中的一种，所述片段化的温度为70℃～95℃。


4.根据权利要求3所述的一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述片段化的时间为5～10分钟，所述片段化的温度为85℃～95℃。


5.根据权利要求1所述的一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述NTP试剂为ATP、CTP、GTP、UTP和TTP中的一种，所述末端转移酶为TDT，所述盐离子缓冲液中的盐离子为Cu2+，所述Cu2+的添加量为0.1nM～1.0nM，所述基团A为叠氮基团，所述基团B为二苯并环辛炔，所述5'端被基团B修饰且含有UMI分子标签的单链接头序列长度为10～50bp，所述5'被基团B修饰且含有分子标签UMI互补序列的单链接头序列由5'修饰随机碱基N、分子标签UMI互补序列以及已知序列A三个部分组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：张腾龙，杨春燕，梁占超，商宇红，师雅宁，段小红，王东亮，
申请(专利权)人：杭州求臻医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33