一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及人MET基因检测技术领域，尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用，其应用为一种检测人MET基因扩增的方法，包括以下步骤：S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增。本发明专利技术敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用
本专利技术涉及人MET基因检测
，尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用。
技术介绍
MET基因位于人类7号染色体长臂(7q31)编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，MET与配体肝细胞生长因子HGF结合后，发生二聚化并引起细胞内多种酪氨酸残基的磷酸化，进而激活一系列下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、生长、迁移、血管生成。cMET基因导致肿瘤可以通过三种形式：MET外显子14突变、MET基因扩增和MET过度表达。研究显示MET基因扩增能激活ErbB3/PI3K/AKT信号途径，引发对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的耐药，MET基因高表达则预后不佳。MET基因扩增导致的EGFR-TKI耐药约占全部EGFR-TKI耐药的9.8～20.0％。因此，MET基因扩增检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，对指导临床开展非小细胞肺癌(NSCLC)的个体化靶向治疗具有重要意义。目前MET基因扩增的检测方法主要有下一代测序(NGS)、荧光原位杂交(FISH)以及荧光定量PCR(qPCR)的方法。下一代测序(NGS)技术能够同时对多个样本同时检测，且可以对多个基因位点检测，但成本较高、实验周期较长，且数据分析复杂；荧光原位杂交(FISH)技术检测MET基因扩增特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，结果判读主观性和专业性较强，临床应用不易推广；荧光定量PCR(qPCR)技术虽然具有重复性好、特异性强等特点，但由于其依赖于标准曲线和Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。因此，迫切需要一种新的MET基因扩增检测方案来克服上述缺陷。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用，敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增；所述步骤S2中的具体反应步骤如下：S01，制备PCR混合物总体积18-22μL：其中14-18μL使用2XddPCRMasterMix(Bio-Rad)和定制的40XTaqMan探针和引物配置的TaqManPCR反应混合物，再加入1-4μL模板DNA；S02，混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad)，每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔PCR反应板，在传统地PCR仪中进行扩增反应。优选地，检测MET基因扩增的引物组合物和探针，包括MET引物组和探针、内参基因引物组和探针；其中用于检测MET基因扩增的上游引物序列：5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；用于检测MET基因扩增的下游引物序列：5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；用于检测MET基因扩增的探针序列：5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；内参基因为RPP30，内参基因的上游引物序列：5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；内参基因的下游引物序列：5'-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；内参基因的探针序列：5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。优选地，MET基因扩增区域的探针SEQIDNo.3和内参基因的探针SEQIDNO.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团；MET基因扩增区域的探针SEQIDNO.3和内参基因的探针SEQIDNO.6的3'端均可独立的结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上，依次为荧光基团，探针序列，MGB修饰基团和淬灭基团。优选地，MET基因探针标记的荧光基团为FAM。优选地，RPP30内参基因探针标记的荧光基团为VIC。优选地，MET基因探针和RPP30内参基因标记的淬灭基团为NFQ。优选地，PCR反应混合物中用于MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μM，进一步优选地，为0.8μM。优选地，PCR反应混合物中用于MET基因扩增的探针、用于检测MET基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μM，进一步优选地，为0.45μM。优选地，PCR反应混合物中DNA模板地含量为2-3ng/μL，进一步优选地，为2.5ng/μL。优选地，ddPCR反应条件为：88-94℃预变性10-20分钟；91-93℃变性51-58秒，50-54℃退火/延伸72-80s，共进行45-50个循环，11-13℃保持。本专利技术的有益效果：(1)针对MET基因扩增设计了特定序列的引物对和特定序列的探针，实现对MET基因扩增的高灵敏度检测，灵敏度可达到0.001％；(2)可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织DNA，也可以是cfDNA，扩大了该试剂盒的使用范围，实现无创检测MET基因扩增。附图说明图1为样本B的ddPCR具体扩增结果。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本专利技术作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。实施例11)、基于微液滴数字PCR技术检测MET基因扩增的引物和探针的设计与合成基于基因组分析数据，对MET基因进行分析，使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点，从中选择最佳组合如下：MET基因上、下游引物：MET上游引物SEQIDNO1：5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'MET下游引物SEQIDNO2：5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'2)、利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为73bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。3)、MET基因检测探针：SEQIDNO3：5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA选用能够稳定扩增、且经过测试扩增效果跟MET保持一致的基因为内参基因。4)、本实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1，提取受试者全血样本中的cfDNA；/nS2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；/nS3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；/nS4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增；/n所述步骤S2中的具体反应步骤如下：/nS01，制备PCR混合物总体积18-22μL：其中14-18μL使用2X ddPCR Master Mix(Bio-Rad)和定制的40X TaqMan探针和引物配置的TaqMan PCR反应混合物，再加入1-4μL模板DNA；/nS02，混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad)，每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔PCR反应板，在传统地PCR仪中进行扩增反应。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；
S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；
S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；
S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增；
所述步骤S2中的具体反应步骤如下：
S01，制备PCR混合物总体积18-22μL：其中14-18μL使用2XddPCRMasterMix(Bio-Rad)和定制的40XTaqMan探针和引物配置的TaqManPCR反应混合物，再加入1-4μL模板DNA；
S02，混合好地样品加入到液滴反应装置(Bio-Rad)，每个反应通道加入,60-80μL地反应油(Bio-Rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔PCR反应板，在传统地PCR仪中进行扩增反应。


2.根据权利要求1所述的一种检测人MET基因扩增的方法，其特征在于：检测MET基因扩增的引物组合物和探针，包括MET引物组和探针、内参基因引物组和探针；其中用于检测MET基因扩增的上游引物序列：5'-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
用于检测MET基因扩增的下游引物序列：5'-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
用于检测MET基因扩增的探针序列：5'-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
内参基因为RPP30，内参基因的上游引物序列：5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
内参基因的下游引物序列：5'-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
内参基因的探针序列：5'-CTGACCTGAAGGCTCT-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：段小红，杨春燕，王冬冬，丁蕊，张腾龙，周启明，
申请(专利权)人：杭州求臻医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33