本发明专利技术涉及数字PCR技术领域，尤其是指快速检测ROS1基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法，包括用于检测ROS1基因融合突变的引物对和探针，所述引物对和探针根据待测靶标区域设计；根据上述引物对和探针提供一种快速检测ROS1基因融合突变的试剂盒，试剂盒包括上述的引物对和探针；所述引物对、探针或试剂盒地使用方法，该方法包括以下步骤：S1，提取获得肿瘤组织RNA样本；S2，使用上述引物对、探针或试剂盒对RNA样本进行数字PCR反应；S3，判读样本是否发生ROS1基因融合突变。本发明专利技术的方法不受融合伴侣和融合位点影响，能够准确发现导致ROS1基因转录异常的基因融合，同时检测已知和未知融合变异，避免假阴性，实验操作简单，检测周期短，性价比高。性价比高。性价比高。
【技术实现步骤摘要】
快速检测ROS1基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其是指快速检测ROS1基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用。
技术介绍
[0002]活性氧基团基因1(reactive oxygen species 1,ROS1)由一个酪氨酸激酶区域、一个跨膜区域和一个含N端糖基化位点的细胞外区域组成，编码一种受体酪氨酸激酶，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，ROS1重排的阳性率大约为1
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2％，重排位点主要发生在ROS1基因的32
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36外显子。目前已发现ROS1可与多个基因发生融合，如CD74、SLC34A2、EZR、LRIG3和SDC4等，发生融合后会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及下游PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路，从而引起肿瘤的发生。
[0003]临床研究显示，小分子酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼(Crizotinib)对于ROS1融合阳性的NSCLC患者有显著疗效，检测ROS1融合基因可筛选出对ROS1融合基因突变靶向药物受益的患者。
[0004]目前ROS1基因融合常见的方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(ICH)、逆转录荧光PCR(RT
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PCR)和二代测序(NGS)等方法，这些方法都有不同程度的漏检，有些方法检测流程复杂。ROS1包含ROS17个外显子(EXON36
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42)激酶域的3'端与多个融合伴侣融合，使自身3'端与5'端产生了明显的表达差异，基于这一表达特点，本专利技术设计了通过检测ROS1基因mRNA的3'端表达量与5'端表达量的定量差异来检测融合突变。
技术实现思路
[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供快速检测ROS1基因融合突变的引物对、探针、试剂盒及其使用，不受融合伴侣和融合位点影响，能够准确发现导致ROS1基因转录异常的基因融合，同时检测已知和未知融合变异，避免假阴性，而且实验操作简单，检测周期短，性价比高，为靶向药物ROS1抑制剂的临床治疗应用提供指导。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]用于检测ROS1基因融合突变的引物对和探针，所述引物对和探针根据待测靶标区域设计：所述待测靶标区域的筛选来自ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域，其中ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的探针分别用不同的荧光基团进行标记；所述待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40
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60％；所述引物对和探针地长度范围为10
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30bp，更优选地为15
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25bp，使引物Tm值为40
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70℃，探针Tm值达到60
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75℃。
[0008]优选地，所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在39外显子之后的区域；所述的ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在32外显子之前的区域。
[0009]优选地，所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针，其中ROS1基因上游引物位于ROS1基因外显子39，下游引物位于ROS1基因外显子40，所述探针位于ROS1基因外显子39
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40拼接区域。
[0010]优选地，所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的上游引物为SEQ ID NO:1CTTGGAGTTTGTCTGCTGAATG；所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的下游引物为SEQ ID NO:2GTAAAGCCCGGATGGCA；所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的探针为SEQ ID NO:3TGGAACTGATGGAGGGAGGAGACC。
[0011]优选地，所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的引物和探针，其中ROS1基因上游引物位于ROS1基因外显子20，下游引物位于ROS1基因外显子21，所述探针位于ROS1基因外显子20
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21拼接区域。
[0012]优选地，所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的上游引物为SEQ ID NO:4TTTCAAATCCTGTGGAATGGTC；所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的下游引物为SEQ ID NO:5GGACTGGAACCTTATGCCTT；所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的5'端外显子区的探针为SEQ ID NO:6TGGCTAGTGAACAACACTCTTTACCTGT。
[0013]根据上述引物对和探针提供一种快速检测ROS1基因融合突变的试剂盒，试剂盒包括上述的引物对和探针。
[0014]优选地，试剂盒还包括ddPCR Master Mix。
[0015]所述引物对、探针或试剂盒地使用方法，该方法包括以下步骤：
[0016]S1，提取获得肿瘤组织RNA样本；
[0017]S2，使用上述引物对、探针或试剂盒对步骤S1中获得的RNA样本进行数字PCR反应；
[0018]S3，根据步骤S2中数字PCR的扩增结果，判读样本是否发生ROS1基因融合突变，考察3'端拷贝数C3与5'端拷贝数C5的值及其比值R，其判断方法如下：
[0019]当C3和C5中的最小值Min＞4时，如果R值大于20或者小于1/20，则ROS融合为阳性，否则为融合阴性；
[0020]若C3和C5中的最小值为0<Min<＝4时，则R大于50或者小于1/50为融合阳性；
[0021]若C3和C5中的最小值Min＝0时，则C3和C5中的最大值Max>100为融合阳性。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]在本专利技术中，ROS1基因上游引物和下游引物分别位于待扩增靶标区域地两端，所述待扩增靶标区域为ROS1基因断裂位置(通常在32
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36外显子处)的3'端后面的RNA区域。在正常情况下，ROS1基因的3'端RNA在肺组织中含量比5'端低，但当其3'端(即酪氨酸激酶区)发生断裂(通常在32
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36外显子处)后，可与多种伴侣发生融合，这些伴侣基因的强启动子使ROS1基因的3'端实现高表达。而且只有ROS1基因的酪氨酸激酶区发生高表达后，则靶向药物ROS1抑制剂对其产生作用，具有较好的治疗效果。因此，通过检测ROS1基因断裂位点之后的外显子的表达量，则本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测ROS1基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述引物对和探针根据待测靶标区域设计：所述待测靶标区域的筛选来自ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域，其中ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端和之后的3'端外显子区的探针分别用不同的荧光基团进行标记；所述待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40
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60％；所述引物对和探针地长度范围为10
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30bp，更优选地为15
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25bp，使引物Tm值为40
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70℃，探针Tm值达到60
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75℃。2.根据权利要求1所述的用于检测ROS1基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在39外显子之后的区域；所述的ROS1基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的引物对和探针，引物和探针的位置可以在32外显子之前的区域。3.根据权利要求2所述的用于检测ROS1基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针，其中ROS1基因上游引物位于ROS1基因外显子39，下游引物位于ROS1基因外显子40，所述探针位于ROS1基因外显子39
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40拼接区域。4.根据权利要求3所述的用于检测ROS1基因融合突变的引物对和探针，其特征在于：所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的上游引物为SEQ ID NO:1CTTGGAGTTTGTCTGCTGAATG；所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的下游引物为SEQ ID NO:2GTAAAGCCCGGATGGCA；所述ROS1基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的...
【专利技术属性】
技术研发人员：段小红，杨春燕，张腾龙，赵梓君，承康平，周启明，
申请(专利权)人：杭州求臻医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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