一种检测NRAS基因突变的引物和探针、试剂盒及检测方法技术

本申请实施例属于NRAS基因突变检测技术领域，涉及一种检测NRAS基因突变的引物和探针，引物包括G12D突变引物、Q61K突变引物、Q61R突变引物和内控引物，探针包括G12D突变检测探针、Q61K突变检测探针、Q61R突变检测探针和内控检测探针，分别针对NRAS基因G12D突变和NRAS基因Q61K突变、Q61R突变进行检测。本申请还涉及一种检测NRAS基因突变的试剂盒和检测方法。本申请提供的技术方案能够简化操作过程，降低研究成本和技术复杂性，缩短检测时间，同时提高特异性以及检测灵敏度。高特异性以及检测灵敏度。高特异性以及检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测NRAS基因突变的引物和探针、试剂盒及检测方法


[0001]本申请涉及神经母细胞大鼠肉瘤病毒基因同源体(NRAS基因)突变检测
，更具体地，涉及一种检测NRAS基因突变的引物和探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]神经母细胞大鼠肉瘤病毒基因同源体(NRAS基因)是RAS基因家族的一员。RAS基因家族包括KRAS、NRAS、HRAS，是EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)的下游信号通路RAS
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RAF
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MAPK的关键基因，调节细胞的增殖、分化、凋亡、转移等生理过程。
[0003]结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一。在全球范围内，结直肠癌的发病率、病死率位于常见肿瘤的前列。随着精准医疗的发展，表皮生长因子受体抑制剂(EGFRI)如西妥昔单抗逐渐成为结直肠癌一线用药。西妥昔单抗等EGFRI通过抑制EGFR基因的信号的发生，从而抑制肿瘤细胞的增值。研究表明，西妥昔单抗的疗效受RAS基因的状态影响。一个突变的RAS基因会持续激活RAS
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RAF
‑
MAPK信号通路，导致EGFRI抑制细胞生长的效果下降。研究表明，只有RAS基因野生型患者能从西妥昔单抗等EGFRI治疗中获益。2020年版《中国结直肠癌诊疗规范》中推荐在对结直肠癌患者使用西妥昔单抗等EGFRI治疗前，对患者的癌组织RAS基因的突变状态进行鉴定，并只对RAS基因野生型患者用药。因此，判别NRAS基因的突变状态有助于指导西妥昔单抗等EGFRI的使用，为临床用药提供理论参考。
[0004]目前，检测NRAS基因突变的方法主要有可逆末端终止测序法和荧光PCR法。
[0005]扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR(allele
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specific PCR，AS
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PCR)，是一种检测已知单碱基突变的方法。其基本原理是根据靶突变的碱基变化设计引物，这些引物包括一条共用的下游引物和一条特异性上游引物(反之亦可)。共用引物按常规方法进行设计，特异性引物则需根据靶突变的碱基变化进行设置，该引物的3
’
端的第一个碱基应为发生突变的碱基，且与靶突变型匹配。另外，在特异引物的3
’
端的第2～4位碱基引入错配碱基可增强该引物的特异性。在扩增时，如果不存在目的突变的序列，则该引物的3
’
端碱基不能结合并延伸，导致PCR不能发生，随后通过琼脂糖凝胶电泳或其他PCR反应标志物检测是否有目的PCR的产生，从而检测样本中靶突变是否存在。通过该方法，研究人员可以根据临床检测的需求，把检测不同突变的引物组放在不同的PCR反应中实现不同突变的检测；也可以把检测不同突变的引物组放在同一个PCR反应中实现多个突变的联合检测。
[0006]荧光PCR法一般有两种类型——染料法和探针法。染料法是在PCR反应中加入能与双链结合并产生荧光的染料，反应过程中荧光强度的变化即代表PCR产物量的积累，常用于对样本中目的基因的相对定量检测。而探针法一般是指Taqman探针法，是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针是一段能与扩增片段特异结合的寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭基团。探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团淬灭，整体表现为无荧光特性；在PCR开始时，探针结合在DNA任意一
条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5
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端～3
’
端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。通过该方法，荧光信号的积累可作为PCR反应发生的标志物。采用扩增阻碍突变系统结合Taqman荧光探针检测特异性扩增产物。只有当特异性引物3
’
末端碱基与靶基因对应突变型模板完全互补配对时，PCR扩增反应可以正常进行而得到特定产物，荧光信号增强；反之，则无特异性PCR扩增反应，因而观察不到荧光信号增强或其Ct值非常高。
[0007]可逆末端终止测序法也是一种检测NRAS基因突变的方法，通过可逆末端终止测序法对靶基因进行直接测序，检出率准确度接近100％；但是缺点是周期长，需要专门的测序仪，且容易发生交叉污染。

技术实现思路

[0008]本申请实施例所要解决的技术问题是相关技术中NRAS基因突变检测方法检测时间长、样品易污染、灵敏度低、对操作人员、仪器和环境要求高等。
[0009]为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种检测NRAS基因突变的引物和探针，采用了如下所述的技术方案：
[0010]包括G12D突变位点、Q61K突变位点、Q61R突变位点及内控位点分别对应的引物和探针，其中：
[0011]所述G12D突变位点对应的引物为G12D突变引物，所述G12D突变引物包括G12D突变上游引物为SEQ ID NO:1和G12D突变下游引物为SEQ ID NO:2；
[0012]所述Q61K突变位点对应的引物为Q61K突变引物，所述Q61K突变引物包括Q61K突变上游引物为SEQ ID NO:3和Q61K突变下游引物为SEQ ID NO:5；
[0013]所述Q61R突变位点对应的引物为Q61R突变引物，所述Q61R突变引物包括Q61R突变上游引物为SEQ ID NO:4和Q61R突变下游引物为SEQ ID NO:5；
[0014]所述内控位点对应的引物为内控引物，所述内控引物包括内控上游引物为SEQ ID NO:6和内控下游引物为SEQ ID NO:7；
[0015]所述G12D突变位点对应的探针为G12D突变检测探针，所述G12D突变检测探针为SEQ ID NO:8；
[0016]所述Q61K突变位点对应的探针为Q61K突变检测探针，所述Q61R突变位点对应的探针为Q61R突变检测探针，其中，所述Q61K突变检测探针和所述Q61R突变检测探针均为SEQ ID NO:9；
[0017]所述内控位点对应的探针为内控检测探针，所述内控检测探针为SEQ ID NO:10。
[0018]进一步的，所述G12D突变检测探针、所述Q61K突变检测探针和所述Q61R突变检测探针的核苷酸序列5'端标记有第一荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团和5*Zip；所述内控检测探针的核苷酸序列5'端标记有第二荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团和3*Zip。
[0019]进一步的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第二荧光报告基团为CY5，所述荧光淬灭基团为Eclipse。
[0020]进一步的，所述G12D突变位点、所述Q61K突变位点、所述Q61R突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测NRAS基因突变的引物和探针，其特征在于，包括G12D突变位点、Q61K突变位点、Q61R突变位点及内控位点分别对应的引物和探针，其中：所述G12D突变位点对应的引物为G12D突变引物，所述G12D突变引物包括G12D突变上游引物SEQ ID NO:1和G12D突变下游引物SEQ ID NO:2；所述Q61K突变位点对应的引物为Q61K突变引物，所述Q61K突变引物包括Q61K突变上游引物SEQ ID NO:3和Q61K突变下游引物SEQ ID NO:5；所述Q61R突变位点对应的引物为Q61R突变引物，所述Q61R突变引物包括Q61R突变上游引物SEQ ID NO:4和Q61R突变下游引物SEQ ID NO:5；所述内控位点对应的引物为内控引物，所述内控引物包括内控上游引物SEQ ID NO:6和内控下游引物SEQ ID NO:7；所述G12D突变位点对应的探针为G12D突变检测探针，所述G12D突变检测探针为SEQ ID NO:8；所述Q61K突变位点对应的探针为Q61K突变检测探针，所述Q61R突变位点对应的探针为Q61R突变检测探针，其中，所述Q61K突变检测探针和所述Q61R突变检测探针均为SEQ ID NO:9；所述内控位点对应的探针为内控检测探针，所述内控检测探针为SEQ ID NO:10。2.根据权利要求1所述的检测NRAS基因突变的引物和探针，其特征在于，所述G12D突变检测探针、所述Q61K突变检测探针和所述Q61R突变检测探针的核苷酸序列5'端标记有第一荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团和5*Zip；所述内控检测探针的核苷酸序列5'端标记有第二荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团和3*Zip。3.根据权利要求2所述的检测NRAS基因突变的引物和探针，其特征在于，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第二荧光报告基团为CY5，所述荧光淬灭基团为Eclipse。4.根据权利要1所述的检测NRAS基因突变的引物和探针，其特征在于，所述G12D突变位点、所述Q61K突变位点、所述Q61R突变位点和所述内控位点的引物、探针分别对应的核苷酸序列如下：所述G12D突变上游引物SEQ ID NO：1对应的核苷酸序列为5
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ACTGGTGGTGGTTGGAGCAGAA
‑3’
；所述G12D突变下游引物SEQ ID NO：2对应的核苷酸序列为5
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GACAAGTGAGAGACAGGATC
‑3’
；所述Q61K突变上游引物SEQ ID NO:3对应的核苷酸序列为5
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GACATACTGGATACAGCTGTAA
‑3’
；所述Q61R突变上游引物SEQ ID NO:4对应的核苷酸序列为5
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ACATACTGGATACAGCTGGCTG
‑3’
；所述Q61K突变下游引物和所述Q61R突变下游引物SEQ ID NO:5对应的核苷酸序列为5
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AGGTTAATATCCGCAAATGACT
‑3’
；所述内控上游引物SEQ ID NO:6对应的核苷酸序列为5
’‑
ATATTGTTGCCATCAATGA
‑3’
；所述内控下游引物SEQ ID NO:7对应的核苷酸序列为5
’‑
GAATACGTGAGGGTATGA
‑3’
；所述G12D突变检测探针SEQ ID NO:8对应的核苷酸序列为5
’‑
FAM
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TCCAGAACCACTTTGTAGATGAAT
‑
Eclipse
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5*Zip
‑3’
；
所述Q61K突变检测探针和所述Q61...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，黄志文，王世东，李志超，朱小亚，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：