检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法技术

本发明专利技术提供了检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法，引物由Primer

【技术实现步骤摘要】
检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法


[0001]本专利技术涉及细胞产品质量检测
，尤其是指检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法。

技术介绍

[0002]细胞产品制备质量控制以及患者注射细胞产品后的随访，均要求检测外源病毒载体基因拷贝数，以监控细胞内外源病毒载体基因拷贝数的变化。出于安全性考虑，现行政策要求：细胞产品中的外源病毒载体基因拷贝数不高于5拷贝/细胞。对患者体内的外源CAR或TCR拷贝数进行间接追踪，有利于评估CAR
‑
T或TCR
‑
T细胞在体内的存活。
[0003]现时，国内外相关研究中，普遍使用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qPCR法)进行基因拷贝数的测定。qPCR法是一种灵敏度高、特异性强且可通过实时监控进行定量的核酸检测技术。qPCR法最常用的有两种技术：一种是荧光染料法，但其与DNA亲和力强，通常对PCR反应有抑制作用；另一种是荧光探针法，为序列特异性的TaqMan探针，灵敏度高，特异性强，已经被应用于生物制药的一些领域。国外已有相关文献研究利用探针qPCR法，建立外源基因拷贝数的检测方法，但针对某一采用特定载体的细胞的检测方法并不适用于工作载体或类型不同的细胞的质量控制检测中，对应的引物选择也存在差异。使用qPCR法检测细胞拷贝数时，既要保证能检出目标载体拷贝数，又要屏除细胞本身的核酸序列干扰，所以，引物的选择影响检测结果的可靠性和准确性。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是：设计用于检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物，保证检测结果的可靠性和准确性。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针，引物由Primer
‑
F和Primer
‑
R组成，所述Primer
‑
F的序列示于SEQ ID NO：1，所述Primer
‑
R的序列示于SEQ ID NO：2，探针(Probe)的序列示于SEQ ID NO：3；所述引物用于扩增病毒载体的部分序列和/或相应的互补序列，所述病毒载体的部分序列示于SEQ ID NO：4。
[0007]一种试剂盒，包含质粒标准品以及上述所述的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针。
[0008]进一步地，所述的试剂盒还包含Premix Ex Taq、ROX Reference DyeⅡ和健康人基因组DNA。
[0009]进一步地，所述的试剂盒还包含UltraPure water和孔板。
[0010]进一步地，所述Primer
‑
F的浓度为1～100μmol/L，所述Primer
‑
F的浓度为1～100μmol/L，所述探针的浓度为1～100μmol/L，所述质粒标准品的浓度为1
×
106～9
×
109copies/μL。
[0011]进一步地，所述Primer
‑
F的浓度为10μmol/L，所述Primer
‑
F的浓度为10μmol/L，所
述探针的浓度为10μmol/L，所述质粒标准品的浓度为9
×
107～2
×
108copies/μL的MSGV1标准品。
[0012]一种检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，采用上述所述的试剂盒，以所述质粒标准品构建标准曲线，以所述引物和探针构建qPCR检测体系检测得到细胞基因组中病毒载体的拷贝数。
[0013]进一步地，所述qPCR检测体系包括标准曲线qPCR反应体系和样品qPCR反应体系；所述标准曲线qPCR反应体系由Premix Ex Taq、Primer
‑
F、Primer
‑
R、探针、ROX Reference DyeⅡ、健康人基因组DNA、UltraPure water和质粒标准品组成，所述样品qPCR反应体系由Premix Ex Taq、Primer
‑
F、Primer
‑
R、探针、ROX Reference DyeⅡ、UltraPure water和样品组成。
[0014]进一步地，所述qPCR检测体系的反应程序为：在95
±
1℃的条件下预变性60
±
3s后，循环进行35
‑
42个的PCR反应；所述PCR反应先在95
±
1℃的条件下反应4
‑
7s，然后在在62
±
1℃的条件下反应30
‑
38s。
[0015]进一步地，所述健康人基因组DNA和所述样品均经过相同的样品处理过程处理；所述样品包括待测样品、阴性对照样品和质控样品；所述样品处理过程为样品DNA的提取；所述质粒标准品为MSGV1标准品。
[0016]本专利技术的有益效果在于：通过病毒载体将插入序列整合到细胞的基因组中，部分病毒载体元件序列(例如：示于SEQ ID NO：5的病毒载体元件)和/或相应的互补序列也会被整合到细胞的基因组中。通过所设计的引物和探针，扩增该部分病毒载体元件序列，能够特异性地检测出病毒载体拷贝数。引物和探针的特异性好，所作用的部分病毒载体元件序列与人基因组无相似性，投放引物和探针后，不会扩增任何除该部分病毒载体元件序列以外的序列，因而检测准确度高。此外，引物和探针在应用时，灵敏度高、精密度高。
附图说明
[0017]下面结合附图详述本专利技术的具体结构
[0018]图1为本专利技术的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法的实施例标准曲线图；
[0019]图2为本专利技术的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法的实施例扩增曲线图。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]实施例
[0022]1材料
[0023]1.1样品
[0024]待测样品：细胞样品(CAR
‑
T细胞)(该细胞样品是基于MSGV1
‑
1D3
‑
28Z.1
‑
3mut载体
质粒，经过将插入基因1D3
‑
28Z.1
‑
3mut去除，并插入CAR基因后制备的质粒，利用PG13细胞包装成病毒载体，然后再侵染患者T淋巴细胞，制成的细胞制剂。)
[0025]阴性对照细胞：活化未转导T细胞(NC
‑
T细胞)
[0026]MSGV1标准品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针，其特征在于，引物由Primer
‑
F和Primer
‑
R组成，所述Primer
‑
F的序列示于SEQ ID NO：1，所述Primer
‑
R的序列示于SEQ ID NO：2，探针的序列示于SEQ ID NO：3；所述引物用于扩增病毒载体的部分序列和/或相应的互补序列，所述病毒载体的部分序列示于SEQ ID NO：4。2.一种试剂盒，其特征在于，包含质粒标准品以及权利要求1所述的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含Premix Ex Taq、ROX Reference DyeⅡ和健康人基因组DNA。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含UltraPure water和孔板。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述Primer
‑
F的浓度为1～100μmol/L，所述Primer
‑
F的浓度为1～100μmol/L，所述探针的浓度为1～100μmol/L，所述质粒标准品的浓度为1
×
106～9
×
109copies/μL。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述Primer
‑
F的浓度为10μmol/L，所述Primer
‑
F的浓度为10μmol/L，所述探针的浓度为10μmol/L，所述质粒标准品的浓度为9
×
107～2
×
108copies/μL的MSGV1标准品。7.一种检测细胞基因组中...

【专利技术属性】
技术研发人员：程玉，王俊涛，林庆卿，王明军，
申请(专利权)人：深圳市因诺转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：