一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法技术

本发明专利技术提供了一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，包括以下步骤：S1.提取6株乳酸菌的DNA，测定其浓度及纯度；S2.引物的设计和合成；S3.质粒的提取、酶切、连接与转化；S4.建立qPCR标准曲线；S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量；S6.使用流式细胞术对酸奶中乳酸菌进行计数；S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌；与现有技术相比，本发明专利技术可以对酸奶中6种不同的乳酸菌进行定性定量计数，解决了现有技术中一次qPCR法只能计数一种乳酸菌的缺点，还可以对酸奶中活死菌分布进行统计，并对qPCR法计数结果中活死菌分布进行矫正，解决了qPCR法不区分活死菌的问题。死菌的问题。死菌的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法


[0001]本专利技术涉及农业食品检测
，具体涉及一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法。

技术介绍

[0002]酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质，经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。乳酸菌对人体具有抗结肠癌、抑制腹泻、防止肠道发炎等功能。经有许多临床实验表明，日常服用乳酸菌产品对许多疾病具有潜在的影响。酸奶及奶制品是乳酸菌最好的来源。益生乳酸菌在人体肠道内定植发挥作用需要一定的数量，明确酸奶中乳酸菌数量至关重要。酸奶中乳酸菌含量一直是一个重要指标，国标规定发酵乳中乳酸菌含量不低于1
×
106CFU/mL。
[0003]传统发酵乳中含有嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌，现在市场上含有益生菌的发酵乳种类不断增多，除了含嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌外，还会含有发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌等。现阶段对酸奶中乳酸菌计数普遍采用涂布平板法，虽然涂布平板法具有简便易操作等优点，但是对含有多种乳酸菌的酸奶进行计数时，由于其原理是采用选择性培养基，而乳酸菌大部分性质相近，选择性培养基无法严格区分，且一般耗时长达72h左右。
[0004]现有技术中，还有基于16S rRNA基因对酸奶中某种乳酸菌进行计数的qPCR法。中国专利技术专利CN202010843095公开了一种快速、高灵敏性检测和定量酸奶中动物双歧杆菌BB
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12的方法，但只能对单一菌种进行检测，如换成乳双歧杆菌此方法则不适用，需要重新构建标曲换算拷贝数，因为其模板是16S rRNA，即使同种方法其拷贝数也会不同，故不能作为模式菌株对所有双歧杆菌计数；且该专利的方法无法区分活菌与死菌。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的不足之处，本专利技术提供了一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，可以对酸奶中6种不同的乳酸菌(嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜热链球菌)进行定性定量计数，解决了现有技术中一次qPCR法只能计数一种乳酸菌的缺点，还可以对酸奶中活死菌分布进行统计，并对qPCR法计数结果中活死菌分布进行矫正，解决了qPCR法不区分活死菌的问题。
[0006]本专利技术采用以下技术方案：一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S1.提取6种乳酸菌的DNA，6种乳酸菌为嗜酸乳杆菌(LA)、短乳杆菌(LB)、干酪乳杆菌(LC)、保加利亚乳杆菌(LD)、发酵乳杆菌(LF)、嗜热链球菌(ST)；
[0008]S2.设计6种乳酸菌特异性引物并合成；
[0009]S3.质粒的提取、酶切、连接与转化；
[0010]S4.建立qPCR标准曲线；
[0011]S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量；
[0012]S6.使用流式细胞术对酸奶中乳酸菌进行计数；
[0013]S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌。
[0014]与现有技术相比，本专利技术解决了在混合发酵酸奶中菌群复杂不容易区分计数的难题，首次在混合发酵酸奶中使用qPCR定性定量计数发酵过程中的6种乳酸菌；另外，通过流式细胞术、激光共聚焦结合SYTO9与PI染色剂对酸奶中乳酸菌计数，并矫正qPCR法计数结果中活菌与死菌分布，实现对酸奶中活菌与死菌计数；再者，本专利技术的检测发酵乳中乳酸菌新型qPCR方法，可将传统涂布平板法的检测时间从72h降至12h，并且能够满足多菌株同时计数，填补流式细胞术不能对多菌种定性缺陷。
[0015]进一步地，步骤S1的具体步骤为：将酸奶稀释15倍，然后加入蛋白酶K和SDS(8.0％)，用细菌DNA提取试剂盒提取6株乳酸菌DNA，测定其浓度及纯度，提取的DNA保存在
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20℃的冰箱中。
[0016]进一步地，步骤S2的具体步骤为：选择tuf基因作为靶基因，利用引物设计软件Primer Premier 6，设计6种乳酸菌特异性引物，并将引物在NCBI的BLAST数据库中比对，验证其特异性，将设计完成的引物委托生工生物工程有限公司合成。通过使用tuf基因替代16S rRNA基因可以使该方法所绘制的标准曲线适用于同种所有乳酸菌。6种乳酸菌特异性引物系列如下：
[0017]LA引物1(F)：GTGACAAGGAAGCTCAAGACCAA，
[0018]LA引物1(R)：CCACGACCAGTGATAGTGAATACG，
[0019]LA引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
[0020]LA引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
[0021]LB引物1(F)：AAGCCATTCTTGATGCCAGTTGA，
[0022]LB引物1(R)：ACCAGTAACCGTCGTCTTCAGT，
[0023]LB引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACATTATGAAAG，
[0024]LB引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCCGTAACGG，
[0025]LC引物1(F)：TGAAGGCGACAAGGAACAGGAA，
[0026]LC引物1(R)：AAGCAACAGTACCACGACCAGT，
[0027]LC引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACACTATGAACG，
[0028]LC引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCAAGAATTTCGGAAACAACG，
[0029]LD引物1(F)：TGACGAATACATTCCAACTCCAGAAC，
[0030]LD引物1(R)：TCAACGCTGTCGCCAACCT，
[0031]LD引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，
[0032]LD引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，
[0033]LF引物1(F)：GGAAGTCGTATTCGGACAGAAGGT，
[0034]LF引物1(R)：CTCGCCAGGTCGGTGTTGAA，
[0035]LF引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcTTAGTCGAGCACTTCGGATACCA，
[0036]LF引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttATGGCAGAAAAAGAACATTATGAACG，
[0037]ST引物1(F)：CGTGGTGTTGTTCGTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.提取6种乳酸菌的DNA，所述6种乳酸菌为嗜酸乳杆菌(LA)、短乳杆菌(LB)、干酪乳杆菌(LC)、保加利亚乳杆菌(LD)、发酵乳杆菌(LF)、嗜热链球菌(ST)；S2.设计6种乳酸菌特异性引物并合成；S3.质粒的提取、酶切、连接与转化；S4.建立qPCR标准曲线；S5.分别测定单菌种发酵液和混合发酵酸奶中乳酸菌的含量；S6.使用流式细胞术对酸奶中乳酸菌进行计数；S7.SYTO9与PI染色剂结合激光共聚焦，区分活菌和死菌。2.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：将酸奶稀释15倍，然后加入蛋白酶K和SDS(8.0％)，用细菌DNA提取试剂盒提取6株乳酸菌DNA，测定其浓度及纯度，提取的DNA保存在
‑
20℃环境中。3.根据权利要求1的一种检测发酵乳中乳酸菌的新型qPCR方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤为：选择tuf基因作为靶基因，利用引物设计软件Primer Premier 6，设计6种乳酸菌特异性引物，并将引物在NCBI的BLAST数据库中比对，验证其特异性，6种乳酸菌特异性引物系列如下：LA引物1(F)：GTGACAAGGAAGCTCAAGACCAA，LA引物1(R)：CCACGACCAGTGATAGTGAATACG，LA引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，LA引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，LB引物1(F)：AAGCCATTCTTGATGCCAGTTGA，LB引物1(R)：ACCAGTAACCGTCGTCTTCAGT，LB引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACATTATGAAAG，LB引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCCGTAACGG，LC引物1(F)：TGAAGGCGACAAGGAACAGGAA，LC引物1(R)：AAGCAACAGTACCACGACCAGT，LC引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCTGAAAAAGAACACTATGAACG，LC引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCAAGAATTTCGGAAACAACG，LD引物1(F)：TGACGAATACATTCCAACTCCAGAAC，LD引物1(R)：TCAACGCTGTCGCCAACCT，LD引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAGAAAAAGAACATTACGTTAG，LD引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAGTCGTCAATTTCAGTAACTTGGC，LF引物1(F)：GGAAGTCGTATTCGGACAGAAGGT，LF引物1(R)：CTCGCCAGGTCGGTGTTGAA，LF引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcTTAGTCGAGCACTTCGGATACCA，LF引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttATGGCAGAAAAAGAACATTATGAACG，ST引物1(F)：CGTGGTGTTGTTCGTGTTAATGA，ST引物1(R)：CGGCAATACCTTCATCAAGTTGT，ST引物2(F)：acggccagtgaattcgagctcATGGCAAAAGAAAAATACGATCG，
ST引物2(R)：gaccatgattacgccaagcttTTAAGCTTCGATTTCAGATACGATA...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘道东，范贤康，黎谢飞，吴振，曾小群，时淄航，李纯崴，蔡振东，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：