一种能克服RNA中DNA污染的植原体基因表达定量检测方法技术

本发明专利技术属于植物病原植原体检测技术领域，具体涉及一种能克服RNA中DNA污染的植原体基因表达定量检测方法，步骤一、样品的处理，步骤二、样品总DNA的提取，步骤三、样品总RNA的提取，步骤四、RNA反转录成cDNA，步骤五、待测基因DNA标准品的制备，步骤六、SYBR Green荧光定量PCR，步骤七、标准曲线的制作，步骤八、植原体基因表达量绝对定量的计算。克服了现有技术的不足，在植原体基因表达定量检测时克服残留的微量DNA，获得准确的植原体基因表达绝对定量结果；本检测方法具有准确度高可靠性强的优点，适用于所有植原体基因表达定量检测，可用于筛选植原体看家基因，在植原体数量与植原体基因表达的相关性研究中也具有重要应用价值。表达的相关性研究中也具有重要应用价值。表达的相关性研究中也具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种能克服RNA中DNA污染的植原体基因表达定量检测方法


[0001]本专利技术属于植物病原植原体检测
，具体涉及一种能克服RNA中DNA污染的植原体基因表达定量检测方法。

技术介绍

[0002]植原体(Candidatus phytoplasma)隶属细菌界(Bacteria)硬壁菌门(Firmicutes)柔膜菌纲(Mollicutes)非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)，是一种植物病原原核生物，可导致1000多种植物病害，给农林业生产和生态环境造成重大危害。植原体专性寄生于其寄主植物韧皮部筛管和伴胞中，目前依然难以分离培养，研究中通过对带毒植物进行组织继代培养来保存植原体。因该病原无法体外培养，较难分离纯的植原体DNA、RNA等，多数情况下，提取带毒寄主植物的总DNA和总RNA可满足很多后续实验要求，如植原体基因克隆、植原体定量、植原体基因表达定量等。
[0003]目前，荧光定量PCR已被广泛用于基因表达定量检测，如Taqman探针荧光定量PCR、SYB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能克服RNA中DNA污染的植原体基因表达定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)样品的处理：取样品在液氮低温的条件下研磨至粉末状，再快速分装至两个离心管中，标记两个离心管分别为D和R,分别记录两个离心管内的粉末质量M
D
和M
R
；(2)DNA的提取：提取获取离心管D中样品粉末内含有的DNA，其中离心管D加入裂解液的体积记为V
DA
，氯仿变性离心后转上清的体积记为V
DB
，溶解或洗脱DNA的体积记为V
DC
；(3)RNA的提取：提取获取离心管R中样品粉末内含有的RNA，其中离心管R加入裂解液的体积记为V
RA
，氯仿变性离心后转上清的体积记为V
RB
，溶解或洗脱RNA的体积记为V
RC
；(4)RNA反转录：取步骤(3)收集的RNA，设置实验组和对照组，分别添加不同反应体系的反转录试剂将反转体系中的RNA反录为cDNA，其中反转录体系中total RNA的用量记为V
RE
，反转录体系的总体积记为V
RD
；(5)待测基因DNA标准品的制备：获取待测基因的DNA标准品，测定DNA标准品浓度，记为C
onS
，通过生物信息学软件计算标准品分子量，记为W
M
，将标准品进行10倍梯度稀释制备梯度浓度标准品；(6)SYBR Green荧光定量PCR：在步骤(5)获取的标准品DNA片段内部设计获取qPCR引物，以稀释的标准品、DNA和步骤(4)获取的反转录产物稀释液为模板采用SYBR Green qPCR检测法进行检测，其中DNA模板用量记为V
DD
，cDNA模板用量记为V
RF
；(7)标准曲线的制作：定量获取每微升标准品原液中基因的拷贝数，记为C
STD
，通过EXCEL等统计分析软件将梯度浓度标准品qPCR的Ct值与N值建立线性关系，获得线性方程N＝k*Ct+b，得到实验组Ct值记为Ct
实验组
、对照组Ct值记为Ct
对照组
，得到实验组N值记为N
实验组
，对照组N值记为N
对照组
；其中N为每微升标准品或待测模板溶液中基因拷贝数的lg值，k和b值为常量；(8)植原体基因表达量绝对定量的计算：计算获得每微升待测溶液中基因的拷贝数记为C
TS
，实验组C
TS
记为C
TS实验组
，对照组C
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋传生，王俊刚，王亚丽，樊庆忠，
申请(专利权)人：菏泽学院，
类型：发明
国别省市：