本发明专利技术公开了一种病毒载体的物理滴度检测试剂盒及检测方法，涉及生物检测技术领域。本发明专利技术提供的病毒载体的物理滴度检测试剂盒，采用两步法qPCR反应进行绝对定量病毒基因组拷贝数并间接计算病毒颗粒数，试剂盒中的引物对含有如SEQ ID No 8所示核苷酸序列的病毒载体具有良好的特异性，该试剂盒对含有该种病毒载体的细胞制剂等产品的病毒载体的物理滴度检测具有通用性。本发明专利技术提供的病毒载体的物理滴度检测方法，为两步法，标准品为cDNA的形式，便于保存，且检测过程中去除了样品包装细胞中的基因组DNA，提高了检测结果的准确性。提高了检测结果的准确性。提高了检测结果的准确性。
【技术实现步骤摘要】
一种病毒载体的物理滴度检测试剂盒及检测方法
[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种病毒载体的物理滴度检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
[0002]病毒的物理滴度是指病毒的颗粒数(virion particle)，测定病毒载体的物理滴度可一定程度反映病毒生产的数量和质量。常用的病毒物理滴度检测方法有电镜法直接计数病毒颗粒数，ELISA法检测病毒衣壳蛋白间接计算病毒颗粒数，或qPCR法绝对定量病毒基因组拷贝数并间接计算病毒颗粒数。
[0003]γ
‑
逆转录病毒载体是由逆转录病毒改造而来的复制缺陷型病毒，其无法通过常规的细胞病变法进行病毒滴度的测定，而通常采用病毒对细胞转导的能力作为逆转录病毒载体的滴度，即用逆转录病毒载体转导细胞(如外周血单个核细胞，PBMCs)，检测转导的外源基因如外源T细胞受体(T cell receptor，TCR)的转导率，进而计算其转导滴度。由于转导滴度的检测流程较长(通常需6天以上)，而逆转录病毒载体生产要求收获的病毒原液尽早冻存，不宜长时间存放于常温或4℃环境，因此目前常规法转导滴度的测定不利于逆转录病毒载体生产的快速质量放行。
[0004]商品化的逆转录病毒载体滴度测定试剂盒分为三个步骤：病毒基因组RNA的提取、逆转录、qPCR反应，其中逆转录和qPCR反应通常使用一步法完成，即在一管体系中包含逆转录和qPCR反应的所有试剂，先后完成两步反应。但是该过程要求标准品性质为RNA，而RNA的保存条件较为苛刻。此外，病毒基因组RNA提取的起始样品往往是病毒包装细胞的细胞上清液，在提取过程中需注意去除上清液中的病毒包装细胞基因组DNA(包含有转录病毒基因组RNA用的模板DNA和病毒包装细胞残留DNA)，或在提取后通过额外步骤去除，这些DNA若混杂在病毒基因组RNA提取产物中会造成最终检测结果的偏差。因此，可以考虑将标准品制备为cDNA形式，便于保存。
技术实现思路
[0005]本专利技术所要解决的技术问题是目前商品化的病毒载体滴度测定试剂盒所用标准品的性质为RNA，尤其是逆转录病毒载体，而RNA的提取过程复杂且保存条件苛刻。
[0006]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种病毒载体的物理滴度检测试剂盒，包括引物对及探针；
[0008]所述引物对及探针的核苷酸序列如下所示，或与这些序列具有至少95％同一性的同功能序列；
[0009]Primer
‑
F(SEQ ID No 1)：CGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGC；
[0010]Primer
‑
R(SEQ ID No 2)：GGGATTTTAGGACTCAGGTCGG；
[0011]probe(SEQ ID No 3)：CCCGGCCGCAACCCTGGGAGACG。
[0012]所述探针上连接有荧光基团；
[0013]所述病毒载体的核苷酸序列中包含有如SEQ ID No 8所示的核苷酸序列。
[0014]其进一步地技术方案为，所述探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ
‑
MGB。
[0015]其进一步地技术方案为，还包括qPCR反应缓冲液和DNA提取试剂中的至少一种。
[0016]第二方面，本专利技术提供一种病毒载体的物理滴度检测方法,所述病毒载体的核苷酸序列中包含有如SEQ ID No 8所示的核苷酸序列，所述检测方法包括以下步骤：
[0017]S1、将精确定量的所述病毒载体的RNA标准品作逆转录，获得cDNA标准品，梯度稀释后使用所述的病毒载体的物理滴度检测试剂盒进行qPCR反应，建立标准曲线；
[0018]S2、对初始待测样品以及初始阴性对照样品分别进行RNA提取，获得RNA提取产物；对RNA提取产物依次进行初步DNA去除反应、基因组DNA去除反应及逆转录反应，得到qPCR反应用的待测样品及阴性对照样品；
[0019]S3、将所述待测样品及阴性对照样品的体积稀释预设倍数，使用所述的病毒载体的物理滴度检测试剂盒进行qPCR反应，得到检测值；
[0020]S4、根据所述检测值进行检测结果的有效性判定以及初始待测样品物理滴度的计算，最终获得初始待测样品的病毒载体的物理滴度；
[0021]所述初始待测样品为包含有如SEQ ID No 8所示的核苷酸序列的病毒载体；
[0022]所述初始阴性对照样品为生产所述病毒载体时用的培养液；
[0023]其进一步地技术方案为，所述步骤S1中，将精确定量的所述病毒载体的RNA标准品作逆转录，获得cDNA标准品的操作具体包括：
[0024]S11、以所述病毒载体的质粒作为模板DNA进行扩增，所述模板DNA的5
’
端含有T7启动子以引导RNA的体外转录，获得RNA产物；
[0025]S12、对所述RNA产物清除模板DNA，进行纯化、精确定量其浓度，得到精确定量的RNA标准品；
[0026]S13、将精确定量的RNA标准品依次进行基因组DNA去除反应及逆转录反应，获得cDNA标准品；
[0027]扩增引物的核苷酸序列如下：
[0028]T7
‑
Primer
‑
F(SEQ ID No 4)：
[0029]taatacgactcactatagggAAGCTGGCCAGCGGTCGT；
[0030]Primer
‑
R(SEQ ID No 5)：CGCCTAGAGAAGGAGTGAGG。
[0031]其进一步地技术方案为，所述步骤S2、步骤S13中的逆转录反应用引物序列如下所示：
[0032]RT
‑
new
‑2‑
primer(SEQ ID No 6)：AGAGAAGGAGTGAGGGCTGG。
[0033]其进一步地技术方案为，进行qPCR反应时，反应条件为：95℃预变性60s，然后95℃反应5s，60℃反应34s，反应40个循环。
[0034]与现有技术相比，本专利技术所能达到的技术效果包括：
[0035]本专利技术提供的病毒载体的物理滴度检测试剂盒，采用两步法qPCR反应进行绝对定量病毒基因组拷贝数并间接计算病毒颗粒数，试剂盒中的引物对含有如SEQ ID No 8所示核苷酸序列的病毒载体具有良好的特异性，试剂盒对含有该种病毒载体的细胞制剂等产品的病毒载体的物理滴度检测具有通用性。
[0036]本专利技术提供的病毒载体的物理滴度检测方法，为两步法，标准品为cDNA的形式，便
于保存，且检测过程中去除了样品包装细胞中的基因组DNA，提高了检测结果的准确性。
附图说明
[0037]图1为本专利技术实施例中cDNA标准品的荧光定量PCR标准曲线图；
[0038]图2为本专利技术实施例中cDNA标准品的荧光扩增图。
具体实施方式...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种病毒载体的物理滴度检测试剂盒，其特征在于，包括引物对及探针；所述引物对、探针的核苷酸序列如下所示，或与这些序列具有至少95％同一性的同功能序列；Primer
‑
F：CGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGC；Primer
‑
R：GGGATTTTAGGACTCAGGTCGG；probe：CCCGGCCGCAACCCTGGGAGACG；所述探针上连接有荧光基团；所述病毒载体的核苷酸序列中包含有如SEQ ID No 8所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的病毒载体的物理滴度检测试剂盒，其特征在于，所述探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ
‑
MGB。3.如权利要求1所述的病毒载体的物理滴度检测试剂盒，其特征在于，还包括qPCR反应缓冲液和DNA提取试剂中的至少一种。4.一种病毒载体的物理滴度检测方法，其特征在于，所述病毒载体的核苷酸序列中包含有如SEQ ID No 8所示的核苷酸序列，所述检测方法包括以下步骤：S1、将精确定量的所述病毒载体的RNA标准品作逆转录，获得cDNA标准品，梯度稀释后使用如权利要求1
‑
2任一项所述的病毒载体的物理滴度检测试剂盒进行qPCR反应，建立标准曲线；S2、对初始待测样品以及初始阴性对照样品分别进行RNA提取，获得RNA提取产物；对RNA提取产物依次进行初步DNA去除反应、基因组DNA去除反应及逆转录反应，得到qPCR反应用的待测样品及阴性对照样品；S3、将所述待测样品及阴性对照样品稀释预设倍数，使用如权利要求1
‑
3任一项所述的病毒载体的物理滴度检测试剂盒进行qPCR反应，得到检...
【专利技术属性】
技术研发人员：程玉，王俊涛，张锦玲，林庆卿，陈晓淳，王明军，
申请(专利权)人：深圳市因诺转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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