基于CRISPR/Cas12a技术检测新冠病毒和69/70突变株的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种基于CRISPR/Cas12a技术检测新冠病毒和69/70突变株的方法及试剂盒。本发明专利技术通过LbaCas12a/crRNA系统特异性识别DNA靶标的能力，通过分别设计针对新冠病毒的非突变的靶点69/70和突变靶点69/70缺失的69/70

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas12a技术检测新冠病毒和69/70突变株的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于快速检测新冠病毒 (SARS
‑
CoV
‑
2)野生型和突变株(69/70缺失突变)的方法及试剂盒，具体是利用Cas12a/crRNA特异性快速检测SARS
‑
CoV
‑
2野生型和变异株的69/70缺失突变。

技术介绍

[0002]SARS
‑
CoV
‑
2突变逐渐增加。在英国发现的B.1.1.7突变株中，有一种69/70 缺失突变，该突变是由新冠病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)S蛋白上的69位和70位氨基酸缺失导致，而该缺失可能让病毒的感染力翻倍从而加剧疫情防控的难度。
[0003]新冠病毒检测方法主要分为核酸检测法和抗体检测法，因为灵敏度和特异性的要求，检测新冠病毒突变主要是通过全基因组测序(WGS)或者Sanger测序的方法进行，但是该检测方法速度慢且不适合所有分子诊断实验室。因此开发一种快速的、灵敏的、便捷的、低成本的新冠病毒69/70缺失突变的检测方法及试剂盒对于本领域疫情防控与治疗、新冠突变株的早期发现具有重要意义。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基于 CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的试剂盒。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的方法。该方法是一种利用LbaCas12a/crRNA系统进行新冠病毒野生型和69/70缺失突变株的检测方法。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的试剂盒，包括LbaCas12a、针对69/70位点野生型特异性69/70
‑
crRNA
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W序列、针对69/70 缺失突变株的特异性69/70
‑
crRNA
‑
M序列、针对新冠病毒野生型和突变株特征序列的RT
‑
RAA引物或RT
‑
PCR引物、报告单链DNA分子；
[0008]为了更好的实现本专利技术，所述试剂盒可结合RT
‑
RAA、RT
‑
RPA等恒温扩增技术或者逆转录PCR(RT
‑
PCR)技术进行新冠病毒核酸的逆转录以及扩增；
[0009]优选的，所述试剂盒还包括A Buffer、NEBuffer2.1、RNase Inhibitor、冻干 RT
‑
RAA反应微球、MgAc。
[0010]所述的特异性69/70
‑
crRNA
‑
W序列如SEQ ID NO：1所示，特异性 69/70
‑
crRNA
‑
M序列如SEQ ID NO：2所示，与传统crRNA设计不同，该序列旁的PAM序列为TTC而不是传统的TTTV。
[0011]所述的针对新冠病毒野生型和突变株特征序列的RT
‑
RAA引物为 69/70
‑
RT
‑
RAA
‑
F/R引物组(SEQ ID NO：3～4)，所述RT
‑
RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比对，分析引物
候选区域的突变频率，结合新冠病毒分子流行病学特征及RT
‑
RAA引物需求筛选出来的高效特异序列；
[0012]所述的针对新冠病毒野生型和突变株特征序列的RT
‑
PCR引物为69/70
‑
RT
‑
PCR
‑
F/R引物组(SEQIDNO：5～6)，所述RT
‑
PCR引物是通过新冠病毒高通量序列比对，分析引物候选区域的突变频率，结合新冠病毒分子流行病学特征及RT
‑
PCR引物需求筛选出来的高效特异序列；
[0013]所述的69/70
‑
RT
‑
RAA
‑
F/R引物组用于扩增含有与69/70
‑
crRNA
‑
W和/或69/70
‑
crRNA
‑
M互补的核酸片段；
[0014]所述的69/70
‑
RT
‑
PCR
‑
F/R引物组用于扩增含有与69/70
‑
crRNA
‑
W和/或69/70
‑
crRNA
‑
M互补的核酸片段；
[0015]所述的报告单链DNA分子为SEQIDNO：7或SEQIDNO：8。
[0016]一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
[0017](1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计野生型非突变69/70和突变株69/70缺失位点特异性的69/70
‑
crRNA
‑
W和69/70
‑
crRNA
‑
M序列，与传统crRNA设计不同，该序列旁的PAM序列为TTC而不是传统的TTTV。设计的crRNA序列如序列表中SEQIDNO：1～2所示，再构建69/70
‑
crRNA
‑
W和69/70
‑
crRNA
‑
M体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；
[0018](2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变69/70及突变靶点69/70缺失设计RT
‑
RAA引物，所述RT
‑
RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于千分之一)的序列。再根据RT
‑
RAA引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列中筛选并验证得到扩增效率好且特异性高的序列作为RT
‑
RAA引物，引物序列如序列表中SEQIDNO：3～4所示，对待测核酸样品进行RT
‑
RAA反应，获得RT
‑
RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变69/70以及突变靶点69/70缺失设计RT
‑
PCR引物，所述RT
‑
PCR引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于万分之一)的序列。再根据RT
‑
PCR引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的试剂盒，其特征在于：包括LbaCas12a、针对69/70位点野生型特异性69/70
‑
crRNA
‑
W序列、针对69/70缺失突变株的特异性69/70
‑
crRNA
‑
M序列、针对新冠病毒野生型和突变株特征序列的RT
‑
RAA引物或RT
‑
PCR引物、报告单链DNA分子；所述的特异性69/70
‑
crRNA
‑
W序列如SEQ ID NO：1所示，特异性69/70
‑
crRNA
‑
M序列如SEQ ID NO：2所示；所述的针对新冠病毒野生型和突变株特征序列的RT
‑
RAA引物为SEQ ID NO：3～4所示的69/70
‑
RT
‑
RAA
‑
F/R引物组；所述的针对新冠病毒野生型和突变株特征序列的RT
‑
PCR引物为SEQ ID NO：5～6所示的69/70
‑
RT
‑
PCR
‑
F/R引物组；所述的69/70
‑
RT
‑
RAA
‑
F/R引物组用于扩增含有与69/70
‑
crRNA
‑
W和/或69/70
‑
crRNA
‑
M互补的核酸片段；所述的69/70
‑
RT
‑
PCR
‑
F/R引物组用于扩增含有与69/70
‑
crRNA
‑
W和/或69/70
‑
crRNA
‑
M互补的核酸片段。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的试剂盒，其特征在于：所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。3.一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：(1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计野生型非突变69/70和突变株69/70缺失位点特异性的69/70
‑
crRNA
‑
W和69/70
‑
crRNA
‑
M序列，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～2所示，再构建69/70
‑
crRNA
‑
W和69/70
‑
crRNA
‑
M体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；(2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变69/70及突变靶点69/70缺失设计RT
‑
RAA引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：3～4所示，对待测核酸样品进行RT
‑
RAA反应，获得RT
‑
RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变69/70以及突变靶点69/70缺失设计RT
‑
PCR引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：5～6所示，对待测核酸样品进行RT
‑
PCR反应，获得RT
‑
PCR反应产物；(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的69/70
‑
crRNA
‑
W或69/70
‑
crRNA
‑
M分子、步骤(2)所述RT
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RAA或者RT
‑
PCR反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；(4)反应产物通过荧光或侧流免疫层析试纸检测获得检测结果。4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒野生型和突变株的方法，其特征在于：步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有Digoxin和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5
′‑
Digoxin
‑
NNNNNNNNNNNN
‑
Biotin
‑3′
，见SEQ ID NO：7；用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5
′‑
FAM
‑
NNNNNNNNNNNN

【专利技术属性】
技术研发人员：黄黎珍，左青霞，何昌生，莫国圣，杜红丽，林采玲，万延斌，黄冬超，陈锋，冯冬燕，许万青，孙琪，韩立亚，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：