【技术实现步骤摘要】
肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法
[0001]本专利技术属于检测领域，具体是肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
[0002]肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名，其全名为“肠道上皮细胞微孢子虫”，属于微孢子虫科、肠胞虫属。
[0003]EHP易感染斑节对虾和凡纳滨对虾，2013年EHP在国内首次发现，据报道，EHP侵染对虾肝胰腺部位，感染了肝肠胞虫的对虾一般不像白斑综合征(WSD)、黄头病(YHD)造成的急性肝胰腺坏死出现急性、大规模死亡现象，感染EHP的对虾表现摄食正常，但体色、胃、肠均明显异常，体色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别凡纳滨对虾会出现白便，该病在早期难以发现，往往再养殖30～45d以上才发现生长缓慢、不长个的现象，极易造成饲料损耗，给养殖户的生产活动带来严重影响。
[0004]EHP的感染途径较广，可通过受精卵和虾苗垂直传播，也可以通...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种肝肠胞虫的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采取EHP阳性组织，提取核酸，用常规PCR扩增获取目的产物，主要是SSU rDNA这一段序列，将PCR扩增产物连接到pMD8
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T载体上，制备成重组质粒pMD8
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T
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SSUEHP，将重组质粒pMD8
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T
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SSUEHP在E.coli DH5α中克隆，E.coli DH5α进行生物测序，验证正确后经扩大培养后提取质粒，检测质粒浓度后换算成拷贝数copies/μL，将重组质粒作为标准品储备液使用；S2.QPCR采用SYBR染料法进行，扩增程序为95℃30s，95℃5s、60℃20s，40个循环，在每个循环60℃结束时收集荧光信号，扩增完成后测定产物的溶解曲线；S3.标准曲线建立：将构建好的标准品储备液进行适当稀释，得到1.0
×
103～1.0
×
108copies/μL共6个梯度建立的标准曲线，每个梯度3个平行，通过扩增效率E在90％—110％，相关系数R2≥0.99，来判断标准曲线的质量；S4.进行检测时，提取样品核酸，检测DNA浓度和纯度后与标准品溶液一起进行QPCR实验，根据标准品建立的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨增光，邱梅，牟潜，邢闪闪，赵久莲，杨淑娜，
申请(专利权)人：青岛菲优特检测有限公司，
类型：发明
国别省市：
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