肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：S1.采取EHP阳性组织，提取核酸，用pMD8

【技术实现步骤摘要】
肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法


[0001]本专利技术属于检测领域，具体是肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法。

技术介绍

[0002]肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名，其全名为“肠道上皮细胞微孢子虫”，属于微孢子虫科、肠胞虫属。
[0003]EHP易感染斑节对虾和凡纳滨对虾，2013年EHP在国内首次发现，据报道，EHP侵染对虾肝胰腺部位，感染了肝肠胞虫的对虾一般不像白斑综合征(WSD)、黄头病(YHD)造成的急性肝胰腺坏死出现急性、大规模死亡现象，感染EHP的对虾表现摄食正常，但体色、胃、肠均明显异常，体色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别凡纳滨对虾会出现白便，该病在早期难以发现，往往再养殖30～45d以上才发现生长缓慢、不长个的现象，极易造成饲料损耗，给养殖户的生产活动带来严重影响。
[0004]EHP的感染途径较广，可通过受精卵和虾苗垂直传播，也可以通过污染养殖水体水平传播。切断感染途径能有效防止感染，通过对亲虾与虾苗的检疫，能及早发现病原，防止感染健康虾苗，从而保障对虾养殖行业的根本利益。
[0005]目前，EHP的检测方法主要采用PCR或套式PCR方法，《SCT 7232
‑
2020虾肝肠胞虫病诊断规程》规定了一种虾肝肠胞虫的套式PCR检测方法，这种方法耗时长、检出限高，对于早期感染或者潜伏感染的检出率较低，而且这种方法只能进行定性检测，不能分析肝肠胞虫的感染量。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0008]一种肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
[0009]S1.采取EHP阳性组织，提取核酸，用常规PCR扩增获取目的产物主要是SSU rDNA这一段序列，用pMD8
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T载体在E.coli DH5α中克隆，克隆片段后进行生物测序，验证正确后经扩大培养后提取质粒，检测质粒浓度后换算成拷贝数1.0
×
10
12
copies/μL，将重组质粒作为标准品使用；
[0010]S2.QPCR采用SYBR染料法进行，扩增程序为95℃30s，95℃5s、60℃20s，40个循环，在60℃结束时收集荧光信号，扩增完成后测定产物的溶解曲线；
[0011]S3.标准曲线建立：将构建好的标准品进行10倍梯度稀释，得到1.0
×
103—1.0
×
108copies/μL共6个梯度建立的标准曲线，每个梯度3个平行，通过扩增效率E在90％—110％，相关系数R2≥0.99，来判断标准曲线的质量；
[0012]S4.样品进行检测时，提取样品核酸，检测DNA浓度后和标准品一起进行QPCR实验，
最后根据标准品建立标准曲线后，将检测样品的Ct值代入标准曲线，得到样品的总体拷贝数，在除以样品的核酸浓度得到样品每ng DNA含有的EHP病毒拷贝数。
[0013]作为本专利技术的进一步方案，在S1中，采用软件按荧光定量PCR引物的设计原则，在EHP
‑
SSU rDNA基因保守区域设计多组特异性的扩增引物，经软件分析比较并适当修改优化获得三组评价较理想的引物，并通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对验证特异性后合成。
[0014]作为本专利技术的进一步方案，在S1中，提取质粒pMD8
‑
T
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SSUEHP，测定其浓度并转换为拷贝数，并以10倍梯度稀释至1.0
×
103～1.0
×
108拷贝/μL作为标准品，
–
20℃保存备用。
[0015]作为本专利技术的进一步方案，在S1中，EHP扩增产物可以连接到pUC57、pUC58等克隆载体中构建重组质粒，作为标准品质粒。
[0016]作为本专利技术的进一步方案，在S1中，可以采用FAM、Cy5、ROX、HEX等染料法，或者采用MGB探针法、FRET探针法、分子信标探针法、Amplifluor引物法、LUX引物法等。
[0017]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0018]该荧光定量PCR方法具有耗时较短、通用性强、灵敏度较高、可重复多次使用且易于操作等优点，满足临床上对EHP快速定量检测的需求的同时，且能提高EHP低感染水平如早期感染或潜伏感染的阳性检出率，对于控制该病的传播具有重要意义，相比于现有技术，更加经济实惠，适合大规模推广。
附图说明
[0019]图1是实施例3中标准品溶液的荧光信号；
[0020]图2是实施例3中标准品溶液的溶解曲线；
[0021]图3是实施例3中阴性对照的荧光信号；
[0022]图4是实施例3中阴性对照的溶解曲线；
[0023]图5是实施例3中空白对照的荧光信号；
[0024]图6是实施例3中空白对照的溶解曲线；
[0025]图7是实施例3中根据标准品溶液作出的标准曲线；
[0026]图8是实施例3中标准品DNA为20拷贝/反应时的荧光信号；
[0027]图9是实施例3中标准品DNA为20拷贝/反应时的溶解曲线；
[0028]图10是实施例3中标准品DNA为2拷贝/反应时的荧光信号；
[0029]图11是实施例3中标准品DNA为2拷贝/反应时的溶解曲线；
[0030]图12是实施例4中待测样品的荧光信号；
[0031]图13是实施例4中待测样品的溶解曲线；
具体实施方式
[0032]实施例1：
[0033]采用PrimerExpress软件按荧光定量PCR引物的设计原则，在EHP
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SSU rDNA基因保守区域设计多组特异性的扩增引物，经Oligo软件分析比较并适当修改优化获得三组评价较理想的引物(如下表)，并通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对验证特异性后合成。
[0034][0035]用常规PCR扩增获取目的产物主要是SSU rDNA这一段序列。
[0036]实施例2:
[0037]阳性组织病原核酸的提取及重组质粒标准品的制备。
[0038]采取EHP阳性组织，提取基因组DNA，最后加50～100μL洗脱缓冲液溶解DNA，置于
–
20℃保存备用。
[0039]以EHP阳性组织基因组DNA为模板，灭菌ddH2O为空白对照，进行PCR扩增。参考试剂及仪器使用说明。
[0040]PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD8
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T连接，制备重组质粒pMD8
‑
T
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SSUEHP，转化到Ecoli.DH5α中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝肠胞虫的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采取EHP阳性组织，提取核酸，用常规PCR扩增获取目的产物，主要是SSU rDNA这一段序列，将PCR扩增产物连接到pMD8
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T载体上，制备成重组质粒pMD8
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T
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SSUEHP，将重组质粒pMD8
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T
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SSUEHP在E.coli DH5α中克隆，E.coli DH5α进行生物测序，验证正确后经扩大培养后提取质粒，检测质粒浓度后换算成拷贝数copies/μL，将重组质粒作为标准品储备液使用；S2.QPCR采用SYBR染料法进行，扩增程序为95℃30s，95℃5s、60℃20s，40个循环，在每个循环60℃结束时收集荧光信号，扩增完成后测定产物的溶解曲线；S3.标准曲线建立：将构建好的标准品储备液进行适当稀释，得到1.0
×
103～1.0
×
108copies/μL共6个梯度建立的标准曲线，每个梯度3个平行，通过扩增效率E在90％—110％，相关系数R2≥0.99，来判断标准曲线的质量；S4.进行检测时，提取样品核酸，检测DNA浓度和纯度后与标准品溶液一起进行QPCR实验，根据标准品建立的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨增光，邱梅，牟潜，邢闪闪，赵久莲，杨淑娜，
申请(专利权)人：青岛菲优特检测有限公司，
类型：发明
国别省市：