一种细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡内含物定量分析的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡内含物定量分析的试剂盒及方法，属于细胞外囊泡分离和检测技术领域。本发明专利技术所述试剂盒包括磁珠和与磁珠结合的第一探针，所述第一探针修饰有与磁珠结合的基团和胆固醇。本发明专利技术所述试剂盒能够实现细胞外囊泡的富集，进而进一步实现细胞外囊泡的定量分析或细胞外囊泡内含物的定量分析。量分析或细胞外囊泡内含物的定量分析。量分析或细胞外囊泡内含物的定量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡内含物定量分析的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及细胞外囊泡分离和检测
，具体涉及一种细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡内含物定量分析的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层磷脂膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles，MVs，直径>200nm)和外泌体 (Exosomes，直径<200nm)组成，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液 (血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。近些年的研究发现，细胞外囊泡及其携带的核酸蛋白质等内含物对于疾病的发生，发展具有非常重要的作用，而且细胞外囊泡也被认为是一种新型的药物载体，具有很高的生物兼容性，并且可以穿透血脑屏障，具有非常广阔的应用前景。
[0003]目前，围绕细胞外囊泡的研究主要集中在分离，检测，疾病诊断和药物递送几个方面，其中分离和检测技术是细胞外囊泡相关研究工作的基础。高效快速的分离方法可以提供高纯度和浓度的细胞外囊泡样品，供后续研究工作使用。而灵敏、可靠、方便的检测方法则可以提供关于细胞外囊泡的更多更准确的信息。现有的细胞外囊泡检测技术主要有纳米颗粒跟踪分析 (Nanoparticle tracking analysis，NTA)，透射电子显微镜(Transmissionelectron microscopy，TEM)和蛋白质印记(Western blot，WB)技术。这三种方法是国际细胞外囊泡协会(ISEV)推荐的用于对细胞外囊泡进行分析和鉴定的必需技术。此外，还有纳米流式细胞技术，表面等离子体共振技术，酶联免疫(ELISA)，定量PCR，生物传感和显色法等。其中定量PCR技术主要用于细胞外囊泡中核酸，例如DNA，mRNA，miRNA等，方法也都是比较常规的技术如real time qPCR和digital PCR等。不过，用于细胞外囊泡定量分析的qPCR技术目前尚缺少合适的看家基因作为内参。细胞分析中常用的看家基因如GAPDH，U6，β
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actin等在细胞外囊泡中的表达水平还不够明确，也就是说不确定其是否可以作为看家基因检测细胞外囊泡中的核酸含量。而目前经常被使用的加入cel
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miR
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39外参的做法也有一定的局限性，外参虽然可以消除因细胞外囊泡提取导致样本量损失引起的误差，但是不能够衡量不同样本中细胞外囊泡总量的差异，也会带来误差。因此抛开细胞外囊泡的数量而单纯地考察基因表达的定量方法是不够准确的。例如，某个细胞外囊泡样本中miR
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122含量高于另一个细胞外囊泡样本，但是由于没有合适的内参基因，我们不知道两个样本中细胞外囊泡总量是否相同，那么也就不确定miR
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122含量升高是由于本身细胞外囊泡中内含物丰富还是细胞外囊泡数量多引起的。而两者之间的区别对于研究肿瘤细胞外囊泡的功能和机制具有非常重要的意义。尽管可以用NTA技术来表征细胞外囊泡数量的多少，但是NTA本身也有一些缺陷，比如样品量大，设备昂贵，一般需要外送样品进行测试，而且对样品中尺寸差不多的杂蛋白缺乏分辨能力。综上所述，亟需寻找细胞外囊泡的高效分离或检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡内含物定量分析的试剂盒及方法。本专利技术所述试剂盒能够实现细胞外囊泡的富集(即分离)，进而进一步实现细胞外囊泡的定量分析或细胞外囊泡内含物的定量分析。
[0005]本专利技术提供了一种用于细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡的内含物定量分析的试剂盒，所述试剂盒包括磁珠和与磁珠结合的第一探针，所述第一探针修饰有与磁珠结合的基团和胆固醇。
[0006]优选的是，所述第一探针的一端标记胆固醇，另一端标记与磁珠结合的基团；所述与磁珠结合的基团包括生物素、氨基、羧基或环氧基。
[0007]优选的是，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选的是，当所述试剂盒用于细胞外囊泡定量分析时，所述试剂盒还包括第二探针；所述第二探针的一端标记有胆固醇。
[0009]优选的是，所述第二探针的核苷选序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选的是，所述细胞外囊泡的内含物包括细胞外囊泡的miRNA、细胞外囊泡的mRNA或细胞外囊泡的表面蛋白。
[0011]优选的是，当所述试剂盒用于细胞外囊泡的表面蛋白的定量分析时，所述试剂盒还包括第三探针；所述第三探针含针对待测蛋白设计的核苷适配体序列。
[0012]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒捕获细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
[0013]将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；
[0014]从样品中提取细胞外囊泡，得到细胞外囊泡溶液；
[0015]将细胞外囊泡溶液与固定有第一探针的磁珠混合，实现细胞外囊泡的捕获。
[0016]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒检测细胞外囊泡浓度的方法，包括以下步骤：
[0017]将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；
[0018]将不同浓度的细胞外囊泡溶液和待测细胞外囊泡溶液分别与固定有第一探针的磁珠混合，清洗，得到捕获的细胞外囊泡；
[0019]将捕获的细胞外囊泡与第二探针混合，清洗，得到固定有第二探针的细胞外囊泡；将固定有第二探针的细胞外囊泡与双蒸水混合，90～100℃加热 5～15min，冷却后置于磁力架上，取上清作为模板，使用针对第二探针的核苷酸序列设计得到的引物进行qPCR扩增，以不同浓度的细胞外囊泡的浓度为横坐标，以qPCR扩增得到的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，根据待测细胞外囊泡的Ct值确定待测细胞外囊泡的浓度。
[0020]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒对细胞外囊泡的 mRNA进行定量分析的方法，包括以下步骤：
[0021]将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；
[0022]将不同浓度的细胞外囊泡溶液分别与固定有第一探针的磁珠混合，得到捕获的细胞外囊泡；
[0023]将捕获的细胞外囊泡与DEPC水混合，90～100℃加热5～15min，冷却后置于磁力架上，取上清作为模板，利用针对待测mRNA设计的引物对进行RT
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qPCR扩增，以细胞外囊泡的
浓度作为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，得到细胞外囊泡浓度与Ct值的关系，Ct值代表细胞外囊泡内mRNA的含量。
[0024]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒对细胞外囊泡的 m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞外囊泡捕获或细胞外囊泡定量分析或细胞外囊泡的内含物定量分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括磁珠和与磁珠结合的第一探针，所述第一探针修饰有与磁珠结合的基团和胆固醇。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一探针的一端标记胆固醇，另一端标记与磁珠结合的基团；所述与磁珠结合的基团包括生物素、氨基、羧基或环氧基。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒用于细胞外囊泡定量分析时，所述试剂盒还包括第二探针；所述第二探针的一端标记有胆固醇。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞外囊泡的内含物包括细胞外囊泡的miRNA、细胞外囊泡的mRNA或细胞外囊泡的表面蛋白。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒用于细胞外囊泡的表面蛋白的定量分析时，所述试剂盒还包括第三探针；所述第三探针含针对待测蛋白设计的核苷适配体序列。6.一种基于权利要求1或2所述试剂盒捕获细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；从样品中提取细胞外囊泡，得到细胞外囊泡溶液；将细胞外囊泡溶液与固定有第一探针的磁珠混合，实现细胞外囊泡的捕获。7.一种基于权利要求1～3任一项所述试剂盒检测细胞外囊泡浓度的方法，包括以下步骤：将磁珠与第一探针混合，得到固定有第一探针的磁珠；将不同浓度的细胞外囊泡溶液和待测细胞外囊泡溶液分别与固定有第一探针的磁珠混合，清洗，得到捕获的细胞外囊泡；将捕获的细胞外囊泡与第二探针混合，清洗，得到固定有第二探针的细胞外囊泡；将固定有第二探针的细胞外囊泡与双蒸水混合，90～100℃加热5～15min，冷却后置于磁力架上，取上清作为模板，使用针对第二探针的核苷酸序列设计得到的引物进行qPCR扩增，以不同浓度的细胞外囊泡的浓度为横坐标，以qPCR扩增得到的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，根据待测细胞外囊泡的Ct值...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚波，孙丹阳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：