一种预测玉米植株氮素状态的方法及引物组技术

本发明专利技术涉及预测玉米植株氮素状态的方法及引物组，其预测步骤如下：1)提取对照和测试样品玉米叶片中总RNA并进行反转录；2)实时定量PCR扩增基因Zm00001d024281，Zm00001d039049和Zm00001d037680并获知其相对表达量，将三个基因在对照与测试样品相对表达量比值分别带入线性模型，预测待测玉米品种的氮素状况；本申请在玉米生长过程中利用该标记物指示玉米植株氮素状态，依据该指示结果对玉米进行精确施肥，降低氮肥浪费，提高肥料利用效率，在实际现农业生产中具有广阔的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种预测玉米植株氮素状态的方法及引物组


[0001]本专利技术涉及玉米栽培和分子生物学
，具体涉及一种预测玉米植株氮素状态的方法及其引物。

技术介绍

[0002]玉米是我国重要的粮饲作物，其生长过程中对氮肥需求量极大。为获得较高产量，通常施用过量的化肥。另外，实践中通常采用
‘
一炮轰
’
式施肥方式，即一次性投入大量施肥，不再追肥的方式；这种施肥方式并未遵循玉米对氮肥需求的阶段性规律，因而大量氮肥被浪费。研究表明近年来我国化肥投入和产出极不相称，氮肥投入已远超过当前产量水平的氮肥需求量(孙志梅,武志杰,陈利军,刘永刚.农业生产中的氮肥施用现状及其环境效应研究进展[J].土壤通报,2006(04):782
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786.)。过量施用氮肥并不能保证产量的持续增加，反而导致玉米品质下降(付钰.玉米籽粒品质与氮素供给关系的研究[D].沈阳农业大学,2020.)。农民生产成本增加等问题，另外过量施用氮肥还会造成农田土壤大面积酸化、水体富营养化等环境问题(武良,张卫峰,陈新平,崔振岭,范明生,陈清,张福锁.中国农田氮肥投入和生产效率[J].中国土壤与肥料,2016(04):76
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83.)。
[0003]因此如何合理施用氮肥、充分发挥玉米生产潜力，促进光合产物向籽粒转移成为研究人员重点关注的问题。在保障粮食安全的前提下，精准施肥和提高肥料利用率是解决上述问题的有效手段。开展作物养分精准监测以及变量施肥决策的理论研究对于提高化肥利用率，减少农田环境污染，以及促进农业增产增效具有重要现实意义。
[0004]精准施肥的管理决策取决于对作物氮素营养状况和土壤养分丰缺的精确评价。早期农业工作者通过观察作物外观如叶色、植株生长形态去判断，该方法虽然方法简单但是具有滞后性，当观察到明显的低氮现象时，作物产量和品质已经受到严重影响(Elliott D E,Reuter D J,Growden B,et al.Improved strategies for diagnosing and correcting nitrogen deficiency in spring wheat[J].Journal of plant nutrition,1987,10(9):1761
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1770.)。植株含氮量能够直接反映作物氮素营养状况，并且与作物产量有着较好的相关性。目前，多数作物采用测定植株氮含量作为指示作物营养状态的指标。但是对氮素含量的测定需要专业性较强的人员操作，并操作过程繁琐耗时长，测试成本高，很难实时做出氮素营养状况的诊断结论，这不能满足大范围内对作物养分状况实时诊断的需求。
[0005]氮素与植物叶绿素含量相关，低氮会影响叶绿素形成，所以，利用叶绿素仪测定SPAD(Specialty products agricultural division)值可以反应出作物氮素营养状况。但是SPAD测定结果准确性受到测定环境限制，如果植株同时缺乏两种或两种以上营养元素时，或者出现由病虫害、药害、生理病害等非营养元素引起的与低氮时类似外观症状时，容易造成误判。因此，如何准确并且高通量的探测作物氮素状况，对于指导作物养分诊断研究和精准变量施肥具有重要意义。
[0006]目前关于植物在转录水平上响应低氮胁迫的分子机制有广泛报道。玉米基因组中
大约有五万个编码基因(MaizeGDB)，研究发现低氮处理会导致大约7％的玉米基因在转录水平上发生改变(Xiaofeng S.Yang,Jingrui Wu,Todd E.Ziegler,et al.Gene Expression Biomarkers Provide Sensitive Indicators of in Planta Nitrogen Status in Maize.2011,157(4):1841
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1852.)，而这些变化会将缺氮信号快速地传递到结构蛋白和蛋白酶水平导致植物的生长发育等过程发生变化。然而，具体是哪些基因的转录水平变化表达只与低氮胁迫相关，而与其他响应无关，尚不明确。

技术实现思路

[0007]针对现有玉米植株氮素含量预测技术的缺陷和不足，本申请通过生物信息分析、实时定量PCR，生物统计学分析等技术筛选鉴定氮素响应基因，进而提供一组结构简单、设计合理、使用方便，易高通量操作、简便、准确、快速检测玉米氮素状况的方法。
[0008]具体而言，上述专利技术目的是通过以下技术方案实现的：
[0009]首先，本申请提供了一种预测玉米植株氮素状态的方法，其具体步骤如下：
[0010]3)分别提取郑58以及测试玉米样品的叶穗RNA，反转录获得郑58以及样品cDNA；所述郑58是指充足氮环境生长的郑58玉米植株。
[0011]4)分别以郑58以及玉米样品cDNA为模板，进行实时定量PCR检测，分别检测充足氮郑58和测试玉米样品中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的表达量；再以郑58中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的表达量，分别与测试玉米样品材料对应基因的表达量进行比较(Fold Difference＝郑58/样品材料)，即获取实时定量PCR反应的CT值，利用2
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ΔΔCT
分别计算样品中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281相对表达量，并分别计为x4、x3、x2；
[0012]5)将x4、x3、x2带入函数Y＝1.143+0.017*x2+0.017*x3
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0.302*x4，即获知测试玉米样品氮含量预测值Y；若Y＞1.30，则认为玉米生长达到正常状态，不需要补充氮肥；若Y＜1.22，则认为玉米生长未达到正常状态，需要补充氮肥。
[0013]本申请以充足氮郑58为对照，与其他测试玉米材料的生物标记物基因表达量进行比较(Fold Difference＝郑58/样品材料)，利用线性模型进行预测所获得在足氮环境下的不同样品的氮含量预测值范围为0.72
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1.22；在缺氮环境下的不同样品的氮含量预测值范围为1.30
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1.67。所以在以充足氮郑58作为对照时，当氮含量预测值Y大于1.30时表明玉米生长达到正常状态，不需要补充氮肥；当氮含量预测值Y小于1.22时表明玉米生长未达到正常状态，需要补充氮肥。
[0014]本申请中，术语“充足氮”是指施用足氮为250kgka
‑1(参见文献“Chengsong Liao,Yunfeng Peng,Wei Ma,Renyi Liu,Chunjian Li,and Xuexian Li.(2012).Proteomic analysis revealed nitrogen
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，具体步骤如下：分别以郑58或玉米样品cDNA为模板，进行实时定量PCR检测；再以郑58中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的表达量，与样品对应基因表达量进行比较，获得样品中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的相对表达量，分别计为x4、x3、x2；将x4、x3、x2带入函数Y=1.143+0.017*x2+0.017*x3
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0.302*x4，即获知样品氮含量预测值Y；若Y＞1.30，则认为玉米生长达到正常状态，不需要补充氮肥；若Y＜1.22，则认为玉米生长未达到正常状态，需要补充氮肥。2.如权利要求1所述预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，步骤2）所述实时定量PCR检测是指，以郑58或玉米样品cDNA为模板，分别以基因Zm00001d039049、或基因Zm00001d037680、或基因Zm00001d024281的上游引物为引物I，以基因Zm00001d039049、或基因Zm00001d037680、或基因Zm00001d024281的下游引物为引物II，进行实时定量PCR检测。3.根据权利要求2所述预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，步骤2）所述实时定量PCR检测是指，PCR反应体系：2
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【专利技术属性】
技术研发人员：宁丽华，石习，赵涵，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：