一种单链微核糖核酸的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：S1：制备血清；S2：制备反应液；S3：进行逆转录；S4：制备检测液。本发明专利技术在在制备反应液和进行逆转录时加入乙二胺二邻苯基乙酸钠缩短制备反应液和混合液的时间，加入的谷胱甘肽能够提高后续检测的准确性，进行逆转录时获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸，将制备的检测液通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA，从而进行准确迅速的检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。克隆研究以及临床标本检验。

【技术实现步骤摘要】
一种单链微核糖核酸的检测方法


[0001]本专利技术是一种单链微核糖核酸的检测方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]微RNA(miRNA)是由约22个核糖核苷酸组成的非编码RNA，在细胞发育、凋亡、分化、增值等重要的的生理病理过程中发挥重要作用。在人的体液中，如血液、尿液、唾液等广泛存在miRNA，这些miRNA的表达谱与载组织细胞中一样，在肿瘤等病理状态下会发生特征性的改变，这些特定的miRNA表达谱是肿瘤细胞特异性生物标志物之一，是一种新的无创上性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。因此，建立一种准确迅速的单链微核糖核酸的检测方法尤为必要。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种单链微核糖核酸的检测方法，能够准确迅速的进行检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种单链微核糖核酸的检测方法的制备方法，包括以下步骤：
[0005]S1：制备血清
[0006]S2：制备反应液
[0007]将1
‑
5μL的步骤S1得到的提取液作为待测样品与乙二胺二邻苯基乙酸钠、谷胱甘肽、多聚腺苷酸聚合酶、核糖核酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、乙二胺四乙酸和三磷酸腺苷的水溶液混合后，反应20
‑
30min，得到反应液；
[0008]S3：进行逆转录
[0009]取1
‑
5μL的步骤S2中的反应液，与乙二胺二邻苯基乙酸钠、RNA酶抑制剂、Quant逆转录酶、三磷脱氧核糖核苷、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和逆转录引物的水溶液混合后，反应20
‑
30min，得到混合液；
[0010]S4：制备检测液
[0011]采用上述方案，步骤S1用于制备血清来进行检测，步骤S2用于在miRNA的3
’
端加上多聚腺苷酸尾巴，步骤S2和步骤S3中加入的乙二胺二邻苯基乙酸钠可以提高检测的准确性，现有技术中制备反应液和混合液时间超过了1h，步骤S2中加入的谷胱甘肽能够缩短制备反应液和混合液的时间，提高了检测效率，步骤S3进行逆转录获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸，步骤S4中制备的检测液通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA，从而进行准确迅速的检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
[0012]优选的，步骤S1具体为：取患者的静脉血4
‑
6mL，以12000rpm转速离心15min，分离得到的血清，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测。
[0013]采用上述方案，利用纯化柱纯化后的血清，更有利于检测。
[0014]优选的，步骤S1中，离心的温度为35
‑
40℃。
[0015]优选的，步骤S2中，反应的温度保持为35
‑
40℃。
[0016]采用上述方案，保持多聚腺苷酸聚合酶的高度活性，从而能够有效的在miRNA的3
’
端加上多聚腺苷酸尾巴。
[0017]优选的，步骤S2中，所述水溶液为0.1
‑
1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1
‑
1μg谷胱甘肽、3
‑
5单位多聚腺苷酸聚合酶、0.5
‑
1μg核糖核酸、0.1
‑
1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5
‑
1.5μg氯化钠、0.2
‑
0.6μg乙二胺四乙酸、0.01
‑
0.4μg三磷酸腺苷和40
‑
60μL的40℃纯水充分震荡混匀后形成。
[0018]优选的，步骤S3中，所述水溶液为0.1
‑
1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、10
‑
15单位RNA酶抑制剂、3
‑
5单位Quant逆转录酶、1.5
‑
2μg三磷脱氧核糖核苷、0.5
‑
1μg氯化钠、0.2
‑
0.5μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2
‑
4μg逆转录引物和40
‑
60μL的40℃纯水充分震荡混匀形成。
[0019]采用上述方案，保持Quant逆转录酶的高度活性，从而有效的进行逆转录，获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸。
[0020]优选的，步骤S3中，RNA酶抑制剂为异硫氰酸胍、焦磷酸二乙酯、氧钒核糖核苷复合物中的一种。
[0021]采用上述方案，加入的RNA酶抑制剂可以与多种RNA酶结合，使其失活，避免有影响逆转录过程。
[0022]优选的，步骤S4具体为：将步骤S3中的混合液加入脱氧核糖核酸聚合酶混合液、上游引物和下游引物的混合物中，在70℃条件下反应30s，在40℃条件下，反应2min。
[0023]优选的，步骤S4中，所述混合物由2
‑
4单位脱氧核糖核酸聚合酶、1
‑
4μg上游引物、1
‑
4μg通用型下游引物与40
‑
60μL的40℃纯水充分震荡混合后形成。
[0024]优选的，步骤S4中，上游引物序列为：5
’
—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3
’
，上游引物序列为：5
’
—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3
’
。
[0025]采用上述方案，选取的上游引物序列为miRNA744的上游引物序列。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：在制备反应液和进行逆转录时加入乙二胺二邻苯基乙酸钠缩短制备反应液和混合液的时间，加入的谷胱甘肽能够提高后续检测的准确性，进行逆转录时获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸，制备的检测液通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA，从而进行准确迅速的检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0028]实施例1
[0029]一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：
[0030]S1：制备血清
[0031]取患者的静脉血4mL，以12000rpm转速离心15min分离得到的血清，离心的温度为35℃，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测；
[0032]S2：制备反应液
[0033]将0.1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1μg谷胱甘肽、3单位多聚腺苷酸聚合酶、0.5μg
核糖核酸、0.1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5μg氯化钠、0.2μg乙二胺四乙酸、0.01μg三磷酸腺苷与40μL的40℃纯水充分震荡混合后，将1μL步骤S1得到的提取液加入其中，反应20min，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：制备血清S2：制备反应液将1
‑
5μL的步骤S1得到的提取液作为待测样品与乙二胺二邻苯基乙酸钠、谷胱甘肽、多聚腺苷酸聚合酶、核糖核酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、乙二胺四乙酸和三磷酸腺苷的水溶液混合后，反应20
‑
30min，得到反应液；S3：进行逆转录取1
‑
5μL的步骤S2中的反应液，与乙二胺二邻苯基乙酸钠、RNA酶抑制剂、Quant逆转录酶、三磷脱氧核糖核苷、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和逆转录引物的水溶液混合后，反应20
‑
30min，得到混合液；S4：制备检测液。2.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S1具体为：取患者的静脉血4
‑
6mL，以12000rpm转速离心15min，分离得到的血清，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测。3.根据权利要求2所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S1中，离心的温度为35
‑
40℃。4.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S2中，反应的温度保持为35
‑
40℃。5.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述水溶液为0.1
‑
1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1
‑
1μg谷胱甘肽、3
‑
5单位多聚腺苷酸聚合酶、0.5
‑
1μg核糖核酸、0.1
‑
1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5
‑
1.5μg氯化钠、0.2
‑
0.6μg乙二胺四乙酸、0.01
‑
0.4μg三磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊菲，杨召军，薛帮凯，王立东，田艳维，王硕，
申请(专利权)人：天津津科生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：