一种节约、省时的微量PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种节约、省时的微量PCR方法，属于分子生物学领域。所述方法包括如下加样步骤：1)将PCR预混液加入PCR管管底；2)将DNA模板用水稀释；3)将稀释后的DNA模板全部加入到PCR管，离心混合，得到PCR反应体系。优选地，步骤3)中，将DNA模板加入到PCR管中部管壁。本发明专利技术的方法可在更小体积PCR体系下，提高PCR检测的精密度，降低检测误差，节约试剂，同时减少更换移液器吸头的次数，省时省力。省时省力。

【技术实现步骤摘要】
一种节约、省时的微量PCR方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种节约、省时的微量PCR方法。

技术介绍

[0002]实时荧光定量聚合酶链式反应，称为荧光定量PCR。该检测手段在PCR基础上，加入荧光基团，利用荧光信号变化，对其过程进行实时监测，从而达到对目的基因相对定量的目的。在荧光定量PCR过程中，需要构建PCR反应体系(通常为大于20μl)，包括配置的预混液(酶混合液，引物，灭菌水等)和DNA模板。PCR反应体系的加样，通常是先将配置的预混液分别加至PCR管中，再分别向预混液中加入2μl DNA模板。
[0003]由于每个PCR管中加入的DNA模板体积较小，特别是在需要构建小于20μl体积PCR反应体系，如10μl PCR反应体系时，易出现较大上样误差。且由于每次加入DNA模板时需触及预混液，所以每次模板上样需更换移液器吸头(也称为“枪尖”)，批量操作费时费力，一次性使用的吸头直接丢弃，也造成较大的浪费。
[0004]因此，提供一种节约、省时省力且误差小的PCR方法具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的问题是：提供一种误差小且省时省力的PCR方法。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种PCR反应体系加样方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]1)将PCR预混液加入PCR管管底；
[0009]2)将DNA模板用水稀释3～6倍；
[0010]3)将DNA模板加入到PCR管，离心混合。
[0011]如前述的PCR反应体系加样方法，步骤3)中，将DNA模板加入到PCR管中部管壁。
[0012]如前述的PCR反应体系加样方法，步骤2)中，所述稀释倍数为4.2倍。
[0013]如前述的PCR反应体系加样方法，所述PCR反应体系总体积为10～25μl。
[0014]如前述的PCR反应体系加样方法，所述PCR反应体系总体积为10μl。
[0015]一种PCR方法，所述PCR方法使用前述PCR反应体系加样方法配制PCR反应体系。
[0016]如前述的PCR方法，所述PCR为实时荧光定量PCR。
[0017]本专利技术的有益效果如下：
[0018]1.本专利技术通过加样前稀释DNA模板，可在更小PCR反应体系(10μl)中，提高PCR检测的精密度，节约试剂。
[0019]2.本专利技术通过将DNA模板加到PCR管中部管壁，可减少更换枪尖的次数，省时省力，节约枪尖。
[0020]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0021]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说
明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
具体实施方式
[0022]本专利技术所用试剂和仪器：
[0023]TaKaRaPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(RR820Q，TaKaRa)。
[0024]DNA模板：源于提取的人永生化角质形成细胞(HaCat,China Center for Type Culture Collection，0106)的总RNA逆转录后的cDNA。
[0025]引物：HMGB1 Forward(5
’
to 3
’
，SEQ ID NO.1)：GAGAGGTGGAAGACCAT，HMGB1 Reverse(5
’
to 3
’
，SEQ ID NO.2)：CAGAGCAGAAGAGGAAGA。引物由擎科生物科技有限公司合成。
[0026]8‑
Tube PCR Strips(Bio
‑
Rad，TLS0851)；
[0027]冷冻离心机(Thermo，FRESCO17)；
[0028]常温离心机(Thermo，Legend Micro17)；
[0029]八联管离心机(LABGIC，SCILOX S1010E)；
[0030]移液器2.5μL(Eppendorf公司，0.2
‑
2.5μL)；
[0031]移液器10μL(Eppendorf公司，1
‑
10μL)；
[0032]移液器100μL(Eppendorf公司，10
‑
100μL)；
[0033]移液器1000μL(Eppendorf公司，100
‑
1000μL)；
[0034]PCR仪(Roche，)。
[0035]实施例1、本专利技术的PCR反应体系加样方法
[0036]Real time PCR反应体系配置：
[0037]按照以下体系配置Real time PCR反应体系(10μl)：Premix Ex Taq II(2
×
)，5μl；PCR正向引物(10μM)，0.4μl；PCR反向引物(10μM)，0.4μl；模板DNA(经灭菌水稀释4.2倍)，4.2μl。
[0038]按照所做孔数，计算DNA模板量，按照相应量，将DNA模板用灭菌水稀释4.2倍。并按照所做孔数，计算Premix Ex Taq II(2
×
)和引物含量，按照相应量，将两者混匀，制成预混液。
[0039]将预混液加入相应PCR管管底，5.8μl/管。之后将稀释的DNA模板加入相应PCR管中部管壁，4.2μl/管。加入同样的DNA模板时，无需更换枪尖。
[0040]加样后，用八联管离心机瞬时离心，使PCR预混液和模板充分混合。
[0041]实施例2、本专利技术的PCR反应体系加样方法
[0042]Real time PCR反应体系配置：
[0043]按照以下体系配置Real time PCR反应体系(20μl)：Premix Ex Taq II(2
×
)，15μl；PCR正向引物(10μM)，1μl；PCR反向引物(10μM)，1μl；模板DNA(经灭菌水稀释3倍)，3μl。
[0044]按照所做孔数，计算DNA模板量，按照相应量，将DNA模板用灭菌水稀释3倍。并按照所做孔数，计算Premix Ex Taq II(2
×
)和引物含量，按照相应量，将两者混匀，
制成预混液。
[0045]将预混液加入相应PCR管管底，17μl/管。之后将稀释的DNA模板加入相应PCR管中部管壁，3μl/管。加入同样的DNA模板时，无需更换枪尖。
[0046]加样后，用八联管离心机瞬时离心，使PCR预混液和模板充分混合。
[0047]实施例3、本专利技术的PCR反应体系加样方法
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR反应体系加样方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：1)将PCR预混液加入PCR管管底；2)将DNA模板用水稀释；3)将稀释后的DNA模板全部加入到PCR管，离心混合，得到PCR反应体系。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，将DNA模板加入到PCR管中部管壁。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述稀释倍数为3～6倍。4.如权利要求3所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：