阻碍真菌保守区域逆转录的探针组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种阻碍真菌保守区域逆转录的探针组合物，包括针对18S rRNA和25S rRNA序列保守性区域的114条探针，序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
阻碍真菌保守区域逆转录的探针组合物及其应用


[0001]本专利技术专利涉及一种阻碍真菌保守区域逆转录的探针组合物及其在RNA建库中的应用，属于生物


技术介绍

[0002]病原微生物检测在感染性疾病的诊断中极为重要，而传统的检测方法主要有分离培养和生化鉴定、涂片镜检、免疫学方法、PCR检测、基因芯片技术，这些只能对已知的病原微生物进行检测，而无法对未知的症状进行有效的诊断。随着肠道微生物和病原微生物领域的兴起，许多疾病或症状是多种微生物共同作用的结果。因此，高通量基因组学技术和高通量转录组学技术被用于系统鉴定病理学样本中的微生物种类，为病原微生物致使疾病的诊断提供了强大的诊断工具，被称为宏基因组新一代测序技术(metagenomics next generation sequencing,mNGS)。这种技术是一种无需培养，无偏好性，直接提取临床样本中DNA/RNA，采用高通量测序技术，经过数据库比对与生信分析，一次性完成细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体的检测。但是对于病原微生物中真菌核糖体RNA所占比例较大，并且在这些rRNA在真菌中高度保守，这就导致很难区分这些相同的区域是来源哪一种病原菌同时也占据了测序数据，使得有效的数据较少。这不仅提高了测序的数据量和测序成本，也降低了病原微生物检出的效率和准确性。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种阻碍真菌保守区域逆转录的探针组合物，每条探针能够结合不低于10％的常见真菌rRNA，能够特异高效地识别并结合这些靶真菌rRNA的保守序列区域，并阻碍这些区域RNA的逆转录，同时保留非保守区域rRNA的正常逆转录。
[0004]本专利技术采用的技术方案为：一种真菌18S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征在于，为下表所示的探针混合物
[0005][0006][0007]优选的，所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3
’
端
‑
NH2C6封闭。
[0008]本专利技术还公开了一种真菌25S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征在于，
为下表所示的探针混合物
[0009][0010][0011][0012]优选的，所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3
’
端
‑
NH2C6封闭。
[0013]本专利技术还公开了上述的探针组合物在RNA建库中的应用。
[0014]本专利技术的作用机理：在逆转录缓冲液中，在高温条件下让样本总RNA分子接触探针组合物和随机引物，以使探针与其中的rRNA分子优选形成RNA:DNA的杂交双链，获得高温杂交混合物。
[0015]将获得的高温杂交混合物降温，在低温条件下让总RNA分子接触探针组合物和随机引物，以使随机引物与其它RNA分子形成RNA:DNA的杂交双链，获得低温杂交混合物；探针组合物经锁核酸修饰后Tm值和结合稳定性远高于随机引物，因此探针组合物可以在高温条件下与rRNA结合。而随机引物Tm值很低，只能在低温条件下与其它RNA结合。
[0016]将上述步骤中生成低温杂交混合物接触逆转录酶，生成一链cDNA。生成一链cDNA过程中rRNA无法被逆转录酶作为模板延伸而被去除；
[0017]常规手段完成下游RNA NGS文库的构建。
[0018]本专利技术SILVA数据库中收录的246种常见真菌的18S rRNA和25S rRNA序列保守性区域进行设计，包含114条探针(SEQ ID NO.1
‑
114)，每条探针能够结合不低于10％的常见真菌rRNA，能够特异高效地识别并结合这些靶真菌rRNA的保守序列区域，并阻碍这些区域RNA的逆转录，同时保留非保守区域rRNA的正常逆转录。使用本专利技术公布的真菌rRNA逆转录探针进行RNA mNGS检测具有操作简单(一步操作)、耗时短(2min)、损失小和成本低等优点，并显著提升了RNA mNGS检测技术的有效数据占比、检出率、灵敏度和准确性，非常适用于RNA mNGS的自动化检测。
[0019]本专利技术的有益效果如下：
[0020]1、本专利技术设计了特异性的真菌rRNA保守区域逆转录阻碍探针，能够在逆转录过程中有效去除真菌中大部分重叠部分的rRNA的序列，提高RNA mNGS检测过程中有效数据的占比，降低了测序的成本以及提高病原微生物的检出率。
[0021]2、本专利技术提供的去除真菌rRNA保守区域的逆转录阻碍探针法，操作简单(一步)、耗时短(2min)，非常适用于大规模工业自动化。
[0022]3、本专利技术提供的去除真菌rRNA保守区域的逆转录阻碍探针法，具有高效快速、操作简单、损失小、同时提高了病原微生物的检出率、灵敏度和准确性。
附图说明
[0023]图1真菌rRNA保守区域逆转录阻碍探针作用原理。
[0024]图2三种条件下RNA标准品测序数据中各RNA的占比。
[0025]图3 RNA标准品在不同测序深度下真菌的检测数比较。
[0026]图4三种条件下真菌检测率比较。
[0027]图5不同RNA标准品投入量情况下真菌的检测数比较。
[0028]图6三种条件下病原样本RNA的真菌检出数比较。
[0029]图7不同病原样本RNA投入量的真菌检出数比较。
具体实施方式
[0030]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。
[0031]实施例1真菌rRNA逆转录阻碍去除探针的设计和制备
[0032]本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示。
[0033]表1
[0034][0035][0036][0037][0038][0039]探针及引物序列转录阻碍去除探针组合物，可以适用于多种高通量测序平台，如Illumina、华大MGI
‑
seq、Nanopore或者Pacbio等，应用于转录组学和表观转录组学领域研究等检测范围，用于有效的去除病原微生物样本RNA中的rRNA，提高病原微生物的检出率。
[0040]探针组合物包括针对SILVA数据库中收录的246种真菌rRNA分子保守性区域设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，探针序列及修饰见表1，真菌rRNA包括18S rRNA和25S rRNA的一种或者多种的组合。
[0041]每条单链DNA探针的长度为20nt
‑
25nt；
[0042]每条探针3
’
端被NH2C6修饰封闭，中间含有多个位点的锁核酸修饰，50％的锁核酸位点位于探针5
’
端前三分之一的区域；
[0043]每条探针自身互补值小于5，Tm值大于80℃。
[0044]根据以上条件，设计的真菌rRNA探针组合物包含114条探针，探针序列及修饰如表1所示。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阻碍真菌18S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征在于，为下表所示的探针混合物
2.根据权利要求1所述的阻碍真菌18S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征为：所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3
’
端
‑
NH2C6封闭。3.一种阻碍真菌25S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征在于，为下表所示的探针混合物
4.根据权利要求3所述的阻碍真菌25S rRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢瑶，江翱，陈晶晶，侯策，王嫚，刘倩，曹振，宋东亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：