基于CRISPR系统的液滴诊断系统和方法技术方案

靶向RNA的蛋白用于通过以渺摩尔级灵敏度在液滴中进行检测来提供基于CRISPR的稳健大规模多重诊断。在纳升体积下以相当的灵敏度水平检测DNA和RNA两者可基于单碱基对差异区分靶标与非靶标，可应用于人类健康的多种情形，包括例如病毒检测、细菌菌株分型和灵敏基因分型。型。型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于CRISPR系统的液滴诊断系统和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年11月14日提交的美国临时申请号62/767,070、2019年5月1日提交的美国临时申请号62/841,812和2019年7月5日提交的美国临时申请号62/871,056的权益。以上确认的申请的全部内容特此以引用方式完全并入本文。
[0003]电子序列表引用
[0004]电子序列表(BROD_3830WP_ST25.txt；大小为217KB，创建日期为2019年10月7日)的内容以引用方式整体并入本文。


[0005]本文所公开的主题大体上关于与CRISPR系统的使用相关的液滴诊断。

技术介绍

[0006]在短时间内针对大量样品以高灵敏度和单碱基特异性快速检测核酸的能力具有彻底改革许多疾病的诊断和监测的潜力，提供有价值的流行病学信息，并作为普遍的科学工具。使用能够一次测试大量样品的平台，利用少量样品将提供优于当前技术水平的明显优势。举例来说，qPCR方法灵敏但昂贵，并且依赖于复杂仪器，限制了对于在实验室环境中训练有素的操作员的可用性。其他方法，诸如将等温核酸扩增与便携式平台相结合的新方法(Du等人,2017；Pardee等人,2016)，在护理点(POC)环境中提供了高检测特异性，但由于灵敏度低而应用有些局限。随着核酸诊断变得与各种医疗保健应用越来越相关，能够以低成本实现高特异性和灵敏度的大规模多重化的检测技术在临床和基础研究环境两者中将具有很大的实用性，最终允许对样品进行泛病毒、泛细菌或泛病原体检测。

技术实现思路

[0007]在某些示例性实施方案中，提供了一种多重检测系统，所述多重检测系统包括检测CRISPR系统；用于一种或多种靶分子的光学条形码；以及微流体装置。在一些实施方案中，所述检测CRISPR系统包含靶向DNA或RNA的蛋白、一种或多种被设计成结合至相应靶分子的指导RNA、掩蔽构建体和光学条形码。在一些实施方案中，所述微流体装置包括微孔阵列和在微孔下方的至少一个流动通道，微孔的尺寸被设定成捕获至少两个液滴。
[0008]在一些实施方案中，任选地基于核酸的掩蔽构建体阻遏可检测阳性信号的产生。在其他实施方案中，所述基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽可检测阳性信号或替代地产生可检测阴性信号来阻遏所述可检测阳性信号的产生。在一方面，所述掩蔽构建体是基于RNA的。在某些实施方案中，所述基于RNA的掩蔽构建体包含沉默RNA，所述沉默RNA阻遏由报告构建体编码的基因产物的产生，其中所述基因产物在表达时产生所述可检测阳性信号。
[0009]在一个实施方案中，所述基于RNA的掩蔽构建体是产生所述阴性可检测信号的核酶，并且其中当使所述核酶失活时产生所述阳性可检测信号，所述核酶可以将底物转化为第一种颜色，并且其中当使所述核酶失活时，所述底物转化为第二种颜色。
[0010]在一些实施方案中，所述基于RNA的掩蔽构建体包含可检测配体和掩蔽组分所附接的RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，所述可检测配体是荧光团，并且所述掩蔽组分是猝灭剂分子。
[0011]所述基于RNA的掩蔽构建体可以包含通过桥分子保持呈聚集体的纳米粒子，其中所述桥分子的至少一部分包含RNA，并且其中当所述纳米粒子分散于溶液中时所述溶液经历色移，任选地所述纳米粒子是胶体金属，在一些情况下是胶体金。所述基于RNA的掩蔽构建体还可以包含通过连接分子与一个或多个猝灭剂分子连接的量子点，其中所述连接分子的至少一部分包含RNA。
[0012]在一些情况下，所述基于RNA的掩蔽构建体包含与嵌入剂复合的RNA，其中所述嵌入剂在所述RNA裂解后改变吸光度。在一些情况下，所述嵌入剂是焦宁
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Y或亚甲蓝。
[0013]所述基于RNA的掩蔽剂还可以是RNA适体和/或包含RNA栓系的抑制剂，在一些情况下，所述适体或所述RNA栓系的抑制剂螯合酶，其中所述酶在从所述适体或所述RNA栓系的抑制剂释放后通过作用于底物产生可检测信号。在特定实施方案中，所述适体是抑制酶，并且阻止所述酶催化从底物产生可检测信号的抑制性适体，或者其中所述RNA栓系的抑制剂抑制酶并且阻止所述酶催化从底物产生可检测信号。在一些情况下，所述酶是凝血酶、蛋白C、中性粒细胞弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、辣根过氧化物酶、β
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半乳糖苷酶或小牛碱性磷酸酶。当所述酶是凝血酶时，所述底物可以是与凝血酶的肽底物共价连接的对硝基苯胺，或与凝血酶的肽底物共价连接的7
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氨基
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4甲基香豆素。所述适体可以螯合一对剂，所述剂在从所述适体释放时组合而产生可检测信号。
[0014]在一方面，本文所公开的实施方案涉及用于检测样品中的靶核酸的方法。在一些实施方案中，本文所公开的方法可以包括以下步骤：产生第一组液滴，所述第一组液滴中的每个液滴包含至少一个靶分子和光学条形码；产生第二组液滴，所述第二组液滴中的每个液滴包含检测CRISPR系统，所述检测CRISPR系统包含Cas蛋白(例如靶向RNA的蛋白)和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的指导RNA、基于RNA的掩蔽构建体和任选的光学条形码；将所述第一组液滴和所述第二组液滴组合成液滴汇集物，并使所述组合的液滴汇集物流到微流体装置上，所述装置包括微孔阵列和在微孔下方的至少一个流动通道，所述微孔的尺寸被设定成捕获至少两个液滴；将液滴捕获于所述微孔中并检测在每个微孔中捕获的液滴的光学条形码；将在每个微孔中捕获的液滴合并以在每个微孔中形成合并液滴，所述合并液滴的至少一个子组包含检测CRISPR系统和靶序列；启动检测反应。然后将合并的液滴保持在足以允许一种或多种指导RNA与一种或多种靶分子结合的条件下。所述一种或多种指导RNA与靶核酸的结合进而激活CRISPR蛋白。一旦被激活，CRISPR蛋白随后使掩蔽构建体失活，例如，通过切割掩蔽构建体以使得可检测阳性信号被揭露、释放或产生。可以在一个或多个时间段检测和测量每个合并液滴的可检测信号，当例如存在阳性可检测信号时指示靶分子的存在。所公开的方法可以包括扩增靶分子的步骤，在一些情况下，扩增可以是RPA或PCR。
[0015]在一些实施方案中，靶分子包含于生物样品或环境样品中。在一些实施方案中，所述样品来自人类。在一些实施方案中，生物样品是血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊髓液、水状液或玻璃体液，或任何身体分泌物、渗出物、渗出液，或获自关节的流体，或皮肤或粘膜表面的拭子。在进一步评估之
前，可以进一步处理生物样品，包括例如通过富集或分离目标细胞。
[0016]所述一种或多种指导RNA被设计成结合至包含(合成)错配的相应靶分子，所述错配可以是靶分子中单核苷酸多态性(SNP)或其他单核苷酸变异的上游或下游的错配。所述一种或多种指导RNA可以被设计成检测靶RNA或DNA中的单核苷酸多态性，或RNA转录物的剪接变体。在一些情况下，指导RNA可以被设计成检测病毒感染中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测靶分子的方法，所述方法包括：将第一组液滴和第二组液滴组合成液滴汇集物，所述第一组液滴包含检测CRISPR系统，所述检测CRISPR系统包含Cas蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的指导分子、掩蔽构建体和光学条形码，并且所述第二组液滴包含样品和任选的光学条形码；使所述液滴汇集物流到微流体装置上，所述微流体装置包括微孔阵列和在所述微孔下方的至少一个流动通道，所述微孔的尺寸被设定成捕获至少两个液滴；检测在每个微孔中捕获的所述液滴的所述光学条形码；将在每个微孔中捕获的所述液滴合并以在每个微孔中形成合并液滴，所述合并液滴的至少一个子组包含检测CRISPR系统和靶序列；启动检测反应；以及在一个或多个时间段，任选地以连续方式，测量每个合并液滴的可检测信号。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括扩增所述靶分子的步骤。3.如权利要求2所述的方法，其中所述扩增包括基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)或分枝扩增法(RAM)。4.如权利要求2所述的方法，其中用RPA或PCR进行所述扩增。5.如权利要求1所述的方法，其中所述靶分子包含于生物样品或环境样品中。6.如权利要求5所述的方法，其中所述样品来自人类。7.如权利要求5所述的方法，其中所述生物样品是血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊髓液、水状液或玻璃体液，或任何身体分泌物、渗出物、渗出液，或获自关节的流体，或皮肤或粘膜表面的拭子。8.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种被设计成结合至相应靶分子的指导RNA包含(合成)错配。9.如权利要求8所述的方法，其中所述错配在所述靶分子中的SNP或其他单核苷酸变异的上游或下游。10.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA被设计成检测靶RNA或DNA中的单核苷酸多态性，或RNA转录物的剪接变体。11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA被设计成检测病毒感染中的药物抗性SNP。12.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA被设计成结合至一种或多种对疾病状态具诊断性的靶分子。13.如权利要求12所述的方法，其中所述疾病状态的特征在于药物抗性或易感基因或转录物或多肽的存在或不存在。14.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA被设计成区分一种或多种微生物株系。15.如权利要求12所述的方法，其中所述疾病状态是感染。16.如权利要求15所述的方法，其中所述感染由病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫引起。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA包括至少90种指导RNA。18.如权利要求1所述的方法，其中所述CRISPR蛋白是靶向RNA的蛋白、靶向DNA的蛋白或它们的组合。19.如权利要求18所述的方法，其中所述靶向RNA的蛋白包含一个或多个HEPN结构域。20.如权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个HEPN结构域包含RxxxxH基序序列。21.如权利要求20所述的方法，其中所述RxxxH基序包含R{N/H/K]X1X2X3H序列。22.如权利要求21所述的方法，其中X1是R、S、D、E、Q、N、G或Y，并且X2独立地是I、S、T、V或L，并且X3独立地是L、F、N、Y、V、I、S、D、E或A。23.如权利要求1所述的方法，其中所述靶向RNA的CRISPR蛋白是C2c2。24.如权利要求18所述的方法，其中所述CRISPR蛋白是靶向DNA的蛋白。25.如权利要求24所述的方法，其中所述CRISPR蛋白包含RuvC样结构域。26.如权利要求24所述的方法，其中所述靶向DNA的蛋白是V型蛋白。27.如权利要求24所述的方法，其中所述靶向DNA的蛋白是Cas12。28.如权利要求25所述的方法，其中所述Cas12是Cpf1、C2c3、C2c1或它们的组合。29.如权利要求1所述的方法，其中所述掩蔽构建体是基于RNA的，并且阻遏可检测阳性信号的产生。30.如权利要求29所述的方法，其中所述基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽可检测阳性信号或替代地产生可检测阴性信号来阻遏所述可检测阳性信号的产生。31.如权利要求29所述的方法，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含沉默RNA，所述沉默RNA阻遏由报告构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：哈佛学院院长等麻省理工学院总医院公司，
类型：发明
国别省市：