用于选择功能性适体的方法和组合物技术

本公开内容描述了用于选择功能性适体的组合物和方法。在某些实施方案中，本文提供使用含适体簇的颗粒，从适体文库中鉴定功能性适体的方法。在某些实施方案中，本文提供功能富集的适体群体。在某些实施方案中，本文提供用于选择用于个体化癌症治疗的适体的方法以及用于制备肿瘤递送系统的方法。在某些实施方案中，本文提供组合物，其包含含适体簇的颗粒、靶细胞（例如癌细胞、免疫细胞等）和/或细胞功能的可检测指示剂（例如细胞凋亡、细胞增殖、基因或蛋白质表达的荧光指示剂等）。或蛋白质表达的荧光指示剂等）。或蛋白质表达的荧光指示剂等）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于选择功能性适体的方法和组合物
[0001]相关申请本申请要求于2018年9月28日提交的美国临时专利申请序列号62/738,235的优先权权益，所述美国临时专利申请在此整体引入作为参考。

技术介绍

[0002]适体是可以与特异性靶分子结合的短的单链核酸寡聚物或肽。通常在迭代过程中从候选物的大型随机库选择适体。最近以来，已在体内和体外细胞中成功地选择了适体。
[0003]适体的选择、其结构
‑
功能关系以及其作用机理全都知之甚少。尽管已分辨并报告了多于100种适体结构，但几乎没有鉴定重复的结构基序。
[0004]已描述了各种不同的适体选择方法，用于针对能够结合特定靶的适体富集适体文库。从此类结合富集库中鉴定的某些结合适体，后来已被确定为能够介导对细胞的功能作用。然而，适体与细胞结合的事实并不意味着它将诱导期望的细胞功能。例如，仅与特定靶细胞结合的许多适体对该细胞的功能没有作用，或者可能诱导与所需的完全不同的细胞功能。此外，与靶细胞弱结合和/或与在靶细胞的表面上以低水平表达的抗原结合的功能性适体，无法通过常规的适体选择方法富集。
[0005]因此，在本领域中非常需要允许针对介导所需细胞功能的适体直接富集适体文库的组合物和方法。重要的是，此类方法和组合物使得能够直接鉴定能够调节对目的靶细胞的期望功能作用的适体，其对适体治疗学具有深远的影响。

技术实现思路

[0006]本文公开的是促进针对诱导期望细胞功能的适体，直接富集适体文库的组合物和方法。如本文公开的，本文提供的方法针对与常规基于结合的适体富集方法不同的适体序列来富集适体文库，导致产生高度富含诱导所需细胞功能的适体的适体库。这促进了例如可用作适体治疗剂的功能性适体的鉴定。本文还提供的是根据本文提供的方法产生的功能富集的适体文库，以及使用本文提供的方法鉴定的功能性适体。
[0007]在某些方面，本文提供的是用于生成功能富集的适体群体的方法。在某些实施方案中，该方法包括：（a）使靶细胞与在其上固定适体簇文库的多个颗粒（“适体簇颗粒”）接触，其中至少一个子集的固定化适体簇与至少一个子集的靶细胞结合，以形成细胞
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适体簇颗粒复合物；（b）将细胞
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适体簇颗粒复合物温育足以使细胞
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适体簇颗粒复合物中的至少一些靶细胞经历细胞功能的时间段；（c）检测经历细胞功能的细胞
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适体簇颗粒复合物；（d）将步骤（c）中检测到的包含经历细胞功能的靶细胞的细胞
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适体簇颗粒复合物与其它细胞
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适体簇颗粒复合物分离；并且（e）扩增分离的细胞
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适体簇颗粒复合物中的适体，以生成功能富集的适体群体。在一些实施方案中，步骤（c）和（d）使用流式细胞仪执行。
[0008]在一些实施方案中，细胞功能是细胞活力、细胞死亡（例如细胞凋亡、非程序性细胞死亡）、细胞增殖、基因表达（例如细胞因子表达）、细胞形态、细胞活化、磷酸化、钙动员、脱颗粒、细胞迁移或细胞分化。
[0009]在某些实施方案中，在步骤（b）之前和/或期间，使靶细胞进一步与细胞功能的报告分子（例如，细胞功能的荧光报告分子）接触。在一些实施方案中，在使靶细胞与适体簇颗粒接触之前、期间或之后，使靶细胞与细胞功能的报告分子接触。在某些实施方案中，修饰靶细胞，使得它们在经历细胞功能时表达细胞功能的报告分子（例如，荧光蛋白）。在某些实施方案中，通过检测细胞功能的报告分子，在步骤（c）中检测经历细胞功能的细胞
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适体簇颗粒复合物。在某些实施方案中，细胞功能的报告分子是荧光染料。在一些实施方案中，细胞功能的报告分子是发光染料。在一些实施方案中，荧光和/或发光染料是钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料。在某些实施方案中，细胞功能的报告分子是活化相关标记物、氧化应激报告分子、免疫原性细胞死亡标记物、坏死标记物、细胞分化的标记物、血管生成标记物、细胞凋亡标记物、自噬标记物、细胞活力标记物或离子浓度的标记物。在某些实施方案中，靶细胞不与细胞功能的报告分子接触。在一些实施方案中，通过形态和/或行为的变化来检测经历该功能的细胞。
[0010]在一些实施方案中，该方法进一步包括将步骤（d）中分离的细胞
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适体簇颗粒复合物中的适体簇颗粒与靶细胞分离。在某些实施方案中，经由细胞裂解和离心，步骤（d）中分离的细胞
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适体簇颗粒复合物中的适体簇颗粒。
[0011]在某些实施方案中，该方法进一步包括使分离的适体簇颗粒中的适体与颗粒解离。在一些实施方案中，在步骤（e）之前，通过HPLC纯化来分离所分离的细胞
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适体簇颗粒中的适体。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤（e）之后，经由测序鉴定富集的适体群体。
[0012]在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤（a）之前，生成适体簇颗粒。在某些实施方案中，生成适体簇颗粒的步骤包括：（1）将来自适体文库的多个适体固定在颗粒表面上；并且（2）在颗粒表面上局部地扩增多个固定化适体，以形成适体簇颗粒。在一些实施方案中，使用乳液PCR在步骤（2）中扩增多个固定化适体。
[0013]在一些实施方案中，该方法进一步包括步骤（f）：（i）由步骤（e）的功能富集的适体群体形成适体簇颗粒；并且（ii）使用新近形成的适体簇颗粒重复步骤（a）
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（e），以生成进一步功能富集的适体群体。在一些实施方案中，将步骤（f）重复至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次或至少8次。在一些实施方案中，与步骤（a）的适体簇文库相比，步骤（f）的进一步富集的适体群体具有减少到例如至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2.0、1/2.1、1/2.2、1/2.3、1/2.4或1/2.5的序列多样性。在一些实施方案中，每一轮步骤（f）使适体群体中调节细胞功能的适体富集到例如至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍。
[0014]在某些实施方案中，步骤（f）进一步包括在相继轮的富集中施加限制性条件。在一些实施方案中，限制性条件选自：（i）减少颗粒的总数，（ii）减少适体的拷贝数/颗粒，（iii）减少靶细胞的总数，和/或（iv）减少温育期。在一些实施方案中，该方法包括通过使用易错聚合酶扩增适体的群体，将错误引入适体序列中。
[0015]在一些实施方案中，适体簇中的适体包含具有分子帽的未暴露的单链核酸序列。在一些实施方案中，适体簇包括包含保守序列的区域和随机序列的区域的适体。在一些实施方案中，随机序列的区域是暴露的，并且保守序列的区域是加帽的。在某些实施方案中，
适体簇包括包含化学修饰或非天然核苷酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生成功能富集的适体群体的方法，所述方法包括：（a）使靶细胞与细胞功能的报告分子和在其上固定适体簇文库的多个颗粒（“适体簇颗粒”）接触，其中至少一个子集的固定化适体簇与至少一个子集的靶细胞结合，以形成细胞
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适体簇颗粒复合物；（b）将所述细胞
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适体簇颗粒复合物温育足以使细胞
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适体簇颗粒复合物中的至少一些靶细胞经历细胞功能的时间段；（c）使用所述细胞功能的报告分子，检测经历所述细胞功能的细胞
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适体簇颗粒复合物；（d）将步骤（c）中检测到的包含经历所述细胞功能的靶细胞的细胞
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适体簇颗粒复合物与其它细胞
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适体簇颗粒复合物分离；和（e）扩增分离的细胞
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适体簇颗粒复合物中的适体，以生成功能富集的适体群体。2.权利要求1的方法，其中步骤（c）和（d）使用流式细胞仪执行。3.权利要求1或权利要求2的方法，其进一步包括将步骤（d）中分离的细胞
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适体簇颗粒复合物中的所述适体簇颗粒与所述靶细胞分离。4.权利要求3的方法，其进一步包括使分离的适体簇颗粒中的所述适体与所述颗粒解离的步骤。5.权利要求1至5中任一项的方法，其进一步包括步骤（f）：（i）由步骤（e）的功能富集的适体群体形成适体簇颗粒；并且（ii）使用新近形成的适体簇颗粒重复步骤（a）
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（e），以生成进一步功能富集的适体群体。6.权利要求5的方法，其中步骤（f）重复至少2次。7.权利要求5的方法，其中步骤（f）重复至少3次。8.权利要求5的方法，其中步骤（f）重复至少4次。9.权利要求5
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8中任一项的方法，其中步骤（f）进一步包括在相继轮的富集中施加限制性条件。10.权利要求9的方法，其中所述限制性条件选自：（i）减少颗粒的总数，（ii）减少适体的拷贝数/颗粒，（iii）减少靶细胞的总数，（iv）减少温育期，以及（v）通过使用易错聚合酶扩增适体的群体，将错误引入所述适体序列中。11.权利要求5
‑
10中任一项的方法，其中与步骤（a）的适体簇文库相比，步骤（f）的进一步富集的适体群体具有减少到1/2的序列多样性。12.权利要求5
‑
10中任一项的方法，其中每一轮步骤（f）使所述适体群体中调节细胞功能的适体富集到至少1.1倍。13.权利要求1
‑
12中任一项的方法，其进一步包括在步骤（e）之后，经由测序鉴定富集的适体群体的步骤。14.权利要求1
‑
13中任一项的方法，其进一步包括在步骤（a）之前，生成所述适体簇颗粒的步骤。15. 权利要求14的方法，其中生成所述适体簇颗粒的步骤包括：（1）将来自适体文库的多个适体固定在颗粒表面上；和（2）在颗粒表面上局部地扩增多个固定化适体，以形成所述适体簇颗粒。16.权利要求15的方法，其中使用乳液PCR在步骤（2）中扩增所述多个固定化适体。
17.权利要求1
‑
16中任一项的方法，其中所述适体簇中的适体包含具有分子帽的未暴露的单链核酸序列。18.权利要求1
‑
17中任一项的方法，其中使用乳液PCR制备固定在所述适体簇颗粒上的适体簇。19.权利要求1
‑
18中任一项的方法，其中至少95%的适体簇颗粒个别地包含不多于10个独特适体序列的多重拷贝。20.权利要求1
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18中任一项的方法，其中至少95%的适体簇颗粒个别地包含不多于7个不同适体序列的多重拷贝。21.权利要求1
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18中任一项的方法，其中至少95%的适体簇颗粒个别地包含不多于5个不同适体序列的多重拷贝。22.权利要求1
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18中任一项的方法，其中至少95%的适体簇颗粒个别地包含不多于3个不同适体序列的多重拷贝。23.权利要求1
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18中任一项的方法，其中至少95%的适体簇颗粒个别地包含不多于2个不同适体序列的多重拷贝。24.权利要求1
‑
18中任一项的方法，其中至少95%的适体簇颗粒个别地包含不多于1个不同适体序列的多重拷贝。25.权利要求1
‑
18中任一项的方法，其中所述适体簇颗粒个别地包含不多于1个不同适体序列的多重拷贝。26.权利要求1
‑
25中任一项的方法，其中所述适体簇包含至少50个相同的适体。27.权利要求1
‑
26中任一项的方法，其中所述适体簇的文库包含100至10
14
个不同的适体序列。28.权利要求1
‑
27中任一项的方法，其中所述适体簇的文库包含至少108个不同的适体序列。29.权利要求1
‑
28中任一项的方法，其中所述适体簇包括包含保守序列的区域和随机序列的区域的适体。30.权利要求29的方法，其中所述随机序列的区域是暴露的，并且所述保守序列的区域是加帽的。31.权利要求1
‑
30中任一项的方法，其中所述颗粒选自聚合物珠、琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、丙烯酰胺珠、实心珠、多孔珠、顺磁珠、玻璃珠、可控孔度珠、微珠和纳米颗粒。32. 权利要求1
‑
31中任一项的方法，其中所述颗粒在至少一个维度上具有约25 nm至约30 μm的平均直径。33. 权利要求1
‑
31中任一项的方法，其中所述颗粒在至少一个维度上具有约25 nm、50 nm、100 nm、250 nm、0.5
ꢀµ
m、2
ꢀµ
m、5
ꢀµ
m、10
ꢀµ
m、20
ꢀµ
m或30
ꢀµ
m的平均直径。34.权利要求1
‑
33中任一项的方法，其中所述适体簇的文库包含经由选自结合细胞SELEX、阴性SELEX和体外进化的一种或多种方法预先选择的适体。35.权利要求1至33中任一项的方法，其进一步包括针对与靶细胞结合的适体富集初始适体文库，以生成结合富集的适体群体，然后使用所述结合富集的适体群体来生成步骤（a）的适体簇颗粒。36.权利要求35的方法，其中通过执行一轮或多轮结合细胞SELEX来富集所述初始适体
文库。37. 权利要求35或权利要求36的方法，其中生成所述适体簇颗粒的步骤包括：（1）将来自所述结合富集的适体群体的多个适体固定到颗粒表面上；和（2）在颗粒表面上局部地扩增多个固定化适体，以形成所述适体簇颗粒。38.权利要求1
‑
37中任一项的方法，其中所述适体簇包括包含化学修饰或非天然核苷酸的适体。39.权利要求1
‑
38中任一项的方法，其中所述适体簇包含DNA、RNA或其化学修饰的适体。40.权利要求1
‑
39中任一项的方法，其中所述适体簇用荧光标记物或允许在光学显微镜下的可见性的元件进行标记。41.权利要求1
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40中任一项的方法，其中所述时间段为约10分钟到约5天。42.权利要求1
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40中任一项的方法，其中所述时间段为约1.5小时到约24小时。43.权利要求1
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40中任一项的方法，其中所述时间段为约1.5小时到约2小时。44.权利要求1
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43中任一项的方法，其中所述靶细胞是原核细胞。45.权利要求44的方法，其中所述靶细胞是细菌。46.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：奥妙有限公司，
类型：发明
国别省市：