副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1及其应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；它的有益效果是：（1）将噬菌体展示技术筛选出的与副溶血性弧菌特异性结合的多肽，并制备合成免疫磁性复合物为国内外首次报道；（2）利用本发明专利技术提供的免疫磁性复合物富集效率高达93.52%；（3）利用本发明专利技术提供的免疫磁性复合物可在30min内实现对副溶血性弧菌的分离富集，相较于传统的培养富集方法，大大的节约时间。节约时间。

【技术实现步骤摘要】
副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1及其应用
[0001]本专利申请专利技术专利，专利技术名称:副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1及其应用和副溶血性弧菌特异性结合的多肽及其用途、为分案申请，原申请号2018105138105、申请日为2018
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25专利技术名称：副溶血性弧菌特异性结合的多肽及其用途的分案申请。


[0002]本专利技术属于生物
，具体涉及一种副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1，包括所述多肽在检测副溶血性弧菌中的应用。
技术背景
[0003]副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海产品或盐腌渍品中，它是我国沿海地区最为常见的一种食源性致病菌，主要引起急性胃肠炎甚至败血症。据我国食源性疾病监测网的数据显示，近十年来由副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经超过沙门氏菌，成为我国首要的食源性致病菌。因而加强对食品中副溶血性弧菌的快速准确检测，实施食品安全监控，对预防由副溶血性弧菌引起的食品安全事件十分必要。
[0004]近年来，免疫磁珠分离技术迅速发展起来，其原理是以抗体包被的磁珠为载体，与反应介质中的特异性抗原结合，形成抗原
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抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而特异性捕获分离抗原。在食源性致病菌的检测方面，免疫磁珠分离技术有效结合抗原
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抗体反应的特异性和磁珠的磁场响应性，可实现从复杂基质中对目标菌的快速分离和富集，能够有效消除基质干扰，从而提高检测效率，是有效的样品前处理方法，具有较好的开发应用前景。
[0005]噬菌体展示技术是将不同排列氨基酸组成的具有各种各样局部三维空间结构的多肽分别展示在噬菌体表面构成分子文库，利用病原体与噬菌体上的相应多肽特异结合的特性，进行生物淘洗，获得能够特异性识别病原体的多肽。此种方法获得的噬菌体特异性多肽既具有单克隆抗体特异性的优点，同时又克服了单克隆抗体制备繁琐的缺点，制备耗时短，并且能够进行大量的制备，大大的节约了时间和成本。因此，筛选出副溶血性弧菌特异性结合的多肽，将其与磁珠偶联形成免疫磁性复合物，可实现对食品中的副溶血性弧菌的快速富集与分离，从而可有效缩短检测时间，提高检测的准确性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了对食品中的副溶血性弧菌的快速富集与分离，缩短检测时间，提高检测的准确性，而提供一种副溶血性弧菌特异性结合的多肽。
[0007]副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、2或3所示。
[0008]所述的副溶血性弧菌特异性结合的多肽在制备检测副溶血性弧菌试剂中的应用。
[0009]一种检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：噬菌体免疫磁性复合物；所述的噬菌体免
疫磁性复合物是由下述方法制备的：1. 洗涤链酶亲和素磁珠：震荡重悬磁珠，用移液器移取100
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L磁珠于反应管中，磁性分离，用移液器吸去上清液；用1 m LPBST洗涤充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，重复洗涤共三次； 2. 合成免疫磁性复合物，具体操作如下：取洗涤好的磁珠100 μL/管，弃去上清后加入4 μg多肽修饰的生物素，用PBST将溶液定容至1 mL，置于垂直混合仪上在室温旋转混合60min，磁珠上修饰的链酶亲和素与多肽上修饰的生物素得以结合，将多肽偶联在磁珠表面，通过磁吸分离法获取上清； 3. 洗涤免疫磁性复合物：用1 mLPBST充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，再用1 mLPBST重悬免疫磁性复合物，重复洗涤共三次，获得的免疫磁性复合物4℃保存备用；所述的多肽，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、2或3所示。
[0010]本专利技术提供了副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、2或3所示；它的有益效果是：（1）将噬菌体展示技术筛选出的与副溶血性弧菌特异性结合的多肽，并制备合成免疫磁性复合物为国内外首次报道；（2）利用本专利技术提供的免疫磁性复合物富集效率高达93.52%；（3）利用本专利技术提供的免疫磁性复合物可在30min内实现对副溶血性弧菌的分离富集，相较于传统的培养富集方法，大大的节约时间。
附图说明
[0011]图1是ELISA鉴定多肽V1~3对应单克隆噬菌体与副溶血性弧菌的亲和力结果；图2是三种不同噬菌体多肽免疫磁性复合物富集效率的结果；图3是不同用量的免疫磁性复合物V1富集效率的结果；图4是免疫磁性复合物V1不同富集时间的富集效率的结果。
具体实施方式
[0012]实施例1主要实验材料：随机七肽噬菌体展示文库（Ph.D.
TM Phage Display Libraries）从NEB公司购买；链酶亲和素磁珠（BeaverBeads
TM Streptavidin）从海狸生物医学工程有限公司购买。
[0013]实验试剂：低盐LB培养基：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液，1 g NaCl，200 mL双蒸水，高压灭菌，4℃贮存；LB
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Tet平板：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液, 1 g NaCl, 3 g琼脂粉，200 mL双蒸水，高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml四环素贮液（10 mg/ml），混匀倒平板，4℃避光贮存；LB/IPTG/Xgal平板：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液，1 g NaCl，3 g琼脂粉，200 mL双蒸水，高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml IPTG/Xgal，混匀倒平板，4℃避光贮存；顶层琼脂：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液，1 g NaCl，0.2 g MgCl2·
6H2O，1.4 g琼脂粉，200 mL双蒸水，高压灭菌，4℃贮存；包被液：0.1 M NaHCO3(pH 8.6)，过滤灭菌，室温保存；封闭液：0.1 M NaHCO3(pH 8.6)，5 mg/ml BSA，过滤除菌，4℃贮存。TBS：50 mM Tris
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HCl(pH 7.5)，150 mM NaCl，高压灭菌，室温贮存。TBST：第一轮配制0.1% [v/v] Tween
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20，第二三轮配制0.5% (v/v) Tween
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20；洗脱液：0.2M Gly
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HCl(pH 2.2)，0.1％BSA；中和缓冲液：1 M Tris
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HCl (pH 9.1)；PEG/NaCl； 20% (w/v) PEG
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8000，2.5 M NaCl，高压灭菌，室温贮存；NaI缓
冲液：10 mM Tris
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HCl (pH 8.0)，0.1 mM EDTA，4 M NaI。
[0014]实施例2副溶血性弧菌特异性结合的多肽的筛选和制备副溶血性弧菌特异性结合的多肽的筛选按照“吸附
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洗涤
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洗脱
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的副溶血性弧菌特异性结合的多肽V1在制备检测副溶血性弧菌试剂中的应用。3.一种检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：噬菌体免疫磁性复合物；所述的噬菌体免疫磁性复合物是由下述方法制备的：1）洗涤链酶亲和素磁珠：震荡重悬磁珠，用移液器移取100
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L磁珠于反应管中，磁性分离，用移液器吸去上清液；用1 m LPBST洗涤充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，重复洗涤共三次； 2）合成免疫磁性复合...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋秀玲，翟玥，李娟，徐坤，李丽，陈锋，韩雪飞，赵超，王娟，刘玉申，张惠雯，袁博超，史雪宁，曲世芳，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：