确定样品中PH和钙浓度或氯浓度的方法技术

本公开涉及用于确定生物样品中的pH以及钙(Ca

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】确定样品中PH和钙浓度或氯浓度的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年12月2日提交的美国临时专利申请No.62/774,314的优先权权益，以引用的方式将其全部内容整体并入。
[0003]关于联邦政府资助研究或开发的声明
[0004]本专利技术是在由美国国立卫生研究院(NIH)的国家转化科学促进中心(NCATS)授予的基金号1UL1TR002389
‑
01的美国政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。


[0005]本公开涉及用于确定生物样品中的pH以及钙(Ca
2+
)浓度或氯(Cl
‑
)浓度的方法。更具体地说，本公开涉及能够使用核酸复合物同时确定pH和Ca
2+
浓度或者同时确定pH和Cl
‑
浓度的方法。

技术介绍

[0006]溶酶体是高度融合的细胞器，其调节细胞过程，例如通过与吞噬体融合的先天免疫、经由与质膜融合的细胞膜修复、通过与自噬体融合的自噬、以及经由mTOR途径的营养感应。溶酶体功能障碍对于常见神经紊乱(例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、以及大约60种罕见的、很大程度上无法医治的被称为溶酶体贮积病的遗传病)的病理学很重要。在与溶酶体相关疾病有关的各种病理生理学中，解开其多种作用中的每一种如何受到影响一直具有挑战性。
[0007]总体上来讲，在测定特定的溶酶体功能时，溶酶体被视为单一的群体。然而，最近有前景的研究认为，溶酶体的亚群可能执行任务的子集。实际上，许多细胞类型已经进化出执行不同功能的专门溶酶体。例如，除了溶酶体之外，皮肤细胞还具有黑素体，中性粒细胞具有嗜苯胺蓝粒，细胞毒性T细胞具有分泌性溶酶体，而每个细胞都具有自噬溶酶体。基于物理参数(如溶酶体的运动、形态或在细胞内的空间位置)的功能成像已揭示了表现出不同行为和功能的亚群。例如，自噬溶酶体和溶酶体分别采用管状和囊状形态。还基于溶酶体在细胞内移动的活跃程度，将溶酶体分为两个群体。溶酶体的空间定位正在成为溶酶体功能的相关因素。尽管如此，通过提供将化学型(chemotypes)与功能进行量化关联的能力，在活细胞内以化学方法在溶酶体群体间进行区分的能力将大大有助于对溶酶体生物学的了解。例如，在1960年代，电子显微术和明场成像只能分别根据形态和黑色素含量区分出黑素体成熟的三个阶段。但是，当将蛋白标志物用于黑素体的化学型时，它揭示了黑素体成熟的四个阶段。化学分离揭示了无色的I期黑素体，由于其与溶酶体在物理和形态上高度相似，至到那时为止仍未被鉴别出。但是，仍然没有以化学方法解析溶酶体群体的方法。
[0008]专门溶酶体与普通溶酶体具有不同的蛋白质组成，以使它们腔内的生物化学过程不同。这种腔体生物化学过程是由最佳的化学环境促成的，其中的关键成分是由溶酶体蛋白质组成以自身平衡的方式稳定的高浓度的特定离子。
[0009]H
+
和Cl
‑
是溶酶体中两种高度丰富的离子，对其功能至关重要。事实上，其它细胞器
的这两种离子没有更高的浓度。溶酶体的pH对溶酶体的成熟、货物降解和降解物质的回收而言至关重要。溶酶体中的高腔体Cl
‑
是某些溶酶体驻留水解酶(lysosome
‑
resident hydrolases)的活性所必需的。然而，与其它细胞器不同，溶酶体中的腔体Cl
‑
水平与腔体pH无关。
[0010]Ca
2+
从不同细胞内仓库中受控释放(这引发信号传导级联)后，调节多种细胞功能。溶酶体最近被认为是“酸性Ca
2+
仓库”，而腔体Ca
2+
是其各种功能的核心。例如，帕金森氏病的风险基因(如LRRK2、ATP6AP2、ATP13A2和遗传风险相关的GBA1基因)预计在溶酶体途径中起作用。
[0011]尽管电生理学已使得能够发现释放溶酶体Ca
2+
的几个通道，但是尚未确认溶酶体Ca
2+
输入的介体。溶酶体的Ca
2+
释放通道易于研究，因为可以使用锚定在溶酶体胞浆面的细胞溶质Ca
2+
染料或基因编码的Ca
2+
指示剂来追踪Ca
2+
释放。Ca
2+
释放后，这些探针在溶酶体周围区域中指示细胞溶质Ca
2+
。相比之下，腔体的Ca
2+
无法被量化，从而阻碍了溶酶体Ca
2+
输入物(importers)的研究。因此，尚未在动物中确认到溶酶体Ca
2+
输入物，最接近的证据是爪蟾(Xenopus)CAX基因在过表达时位于溶酶体中。
[0012]无法量化酸性细胞器中的Ca
2+
是因为所有Ca
2+
指示剂都通过羧酸根基团经由与Ca
2+
形成共价键来发挥作用，所述羧酸根基团在酸性pH下变得质子化。这改变了探针对Ca
2+
离子的亲和力。此外，细胞器pH与腔体Ca
2+
的进入和离开有关。因此，解开Ca
2+
对观测到的任何Ca
2+
指示剂的荧光变化的贡献是非常重要的。以前的尝试使用带有pH或Ca
2+
敏感染料的内吞示踪剂(endocytic tracers)来连续测量不同批次细胞中的群体平均pH和表观Ca
2+
，这样一来扰乱了来自单个内体的信息。鉴于内吞细胞器中宽的pH分布，这种方法不能提供研究Ca
2+
输入所需的分辨率。

技术实现思路

[0013]本专利技术人已经确认，本公开的新型核酸复合物能够在有效且准确地确定样品中的Ca
2+
浓度或Cl
‑
浓度的同时，对pH也进行有效且准确的确定。在某些实施方式中，本公开的新型核酸复合物同时确定样品中的pH和Ca
2+
浓度，或者同时确定样品中的pH和Cl
‑
浓度。
[0014]因此，本公开的一个方面提供了核酸复合物，所述核酸复合物包含：
[0015]第一单链核酸分子，所述第一单链核酸分子包含交联至所述第一链的Ca
2+
荧光团或Cl
‑
荧光团；以及
[0016]第二单链核酸分子，所述第二单链核酸分子与所述第一单链分子部分地或完全地互补，
[0017]其中，所述核酸复合物进一步包含第一标记物，所述第一标记物缀合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子，并且所述第一标记物能够产生信号。
[0018]本公开的另一方面提供了使用如本文提供的本公开的核酸复合物同时确定样品中的1)pH、和2)Ca
2+
浓度或Cl
‑
浓度的方法。一般而言，此类方法包括提供本公开的核酸复合物，所述核酸复合物包含Ca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于同时确定样品中的1)pH、和2)Ca
2+
浓度或Cl
‑
浓度的方法，所述方法包括：提供核酸复合物，所述核酸复合物包含第一单链核酸分子和第二单链核酸分子，所述第一单链核酸分子包含交联至所述第一链的Ca
2+
荧光团或Cl
‑
荧光团，所述第二单链核酸分子与所述第一单链分子部分地或完全地互补，其中，所述核酸复合物进一步包含第一标记物，所述第一标记物缀合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子，并且所述第一标记物能够产生信号，其中，所述信号的强度取决于pH的变化；测量所述信号的强度；以及由所测量的信号确定所述pH与Ca
2+
浓度或Cl
‑
浓度。2.如权利要求1所述的方法，其中，测定在早期内体、晚期内体、质膜、溶酶体、自噬溶酶体、循环内体、顺式高尔基体网络、反式高尔基体网络、内质网、过氧化物酶体或分泌囊泡中进行。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸复合物包含交联至所述第一链的Cl
‑
荧光团。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述Cl
‑
荧光团包括10,10'
‑
双[3
‑
羧丙基]
‑
9,9'
‑
二吖啶鎓二硝酸盐。5.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸复合物包含交联至所述第一链的Ca
2+
荧光团。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述Ca
2+
荧光团为单波长指示剂。7.如权利要求5所述的方法，其中，所述交联的Ca
2+
荧光团为：或者其中，包含Ca
2+
荧光团的所述第一单链核酸分子为下式：
其中，R为接头。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中，取决于pH变化的信号的强度根据所述核酸复合物的构象而改变。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中，所述核酸进一步包含缀合至所述第一单链核酸或所述第二单链核酸的第二标记物。10.如权利要求9所述的方法，其中，所述信号的强度根据以下中的至少一种而改变：所述第一标记物和第二标记物之间的距离，以及所述第一标记物和所述第二标记物的相对取向。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中，所述第一单链核酸分子和第二单链核酸在酸性条件下形成i
‑
基序。12.如权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中，所述第二单链核酸能够形成分子内复合物，所述分子内复合物包含在酸性条件下以反平行取向插入的两个以C
‑
HC+碱基配对的平行链双链体。13.如权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中，所述核酸复合物进一步包含第三单链核酸分子，所述第三单链核酸分子与所述第一单链分子部分地互补。14.如权利要求1
‑
13中任一项所述的方法，其中，所述核酸复合物进一步包含靶向部分。15.如权利要求1
‑
14中任一项所述的方法，其中，所述第一单链核酸分子和/或第二单链核酸分子少于200个核苷酸；或少于100个核苷酸；或少于50个核苷酸。16.如权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中，所确定的Ca
2+
浓度在10nM
‑
10mM的范围；或在10nM
‑
1μM的范围；或在1μM
‑
10mM的范围；或者，其中，所确定的Cl
‑
浓度在10nM
‑
10mM的范围；或在10nM
‑
1μM的范围；或在1μM
‑
10mM的范围。17.如权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中，所确定的pH小于pH 5.5；或者，其中，所确定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚穆纳，
申请(专利权)人：芝加哥大学，
类型：发明
国别省市：