一种线性探针及利用其检测miRNA的方法技术

本发明专利技术的线性探针至少包括a、b和c三个区域：所述b区域的3

【技术实现步骤摘要】
一种线性探针及利用其检测miRNA的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，尤其涉及一种线性探针及利用其检测miRNA的方法。

技术介绍

[0002]核酸检测已经广泛应用于临床检测、环境监测、传染病预防与控制等方面。其中，miRNA(miR)是一类由20
‑
25个核苷酸组成的单链非编码RNA，它通过与靶信使RNA的3
’
端非翻译区结合，降解靶信使RNA或者抑制其翻译，在转录或转录后水平调控编码蛋白基因的表达，从而调控细胞分化、生长、增殖、代谢、凋亡等。miRNA的核酸检测具有重要意义。
[0003]传统的miRNA检测方法如northern印迹法，也是目前检测miRNA的金标准。该方法通过探针与靶目标杂交后转膜，显影检测miRNA。该方法灵敏度不高且要求RNA样本量大。研制夹板连接同位素探针技术检测miRNA，但需要应用PAGE电泳分离、放射自显影等复杂操作。随着新技术的不断引入和学科的交叉研究，新型miRNA分析方法被不断研发。如miRNA原位杂交分析，使用荧光标记探针与细胞或组织中的miRNA杂交，通过显色或荧光成像检测miRNA表达，直观展现miRNA的时空表达模式，但由于miRNA序列短，miRNA在杂交及洗脱过程中易丢失，易出现假阴性；微阵列芯片法通过固定探针，使miRNA目标分子与微阵列杂交，采用同位素、荧光、化学发光或电化学进行检测，实现高通量、多组分同时检测，但其灵敏度和特异性有待进一步加强。
[0004]PCR法是核酸检测灵敏度最高的方法之一，但是由于miRNA太短，以其直接作为模板不能有效设计PCR引物。研究人员开发线性探针RT
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PCR法和茎环探针RT
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PCR方法，用于miRNA的检测。已有的线性探针RT
‑
PCR法，采用一条3
’
末端含有与靶标miRNA的3
’
端互补碱基的线性探针，通过互补和聚合延伸进行逆转录，延长逆转录产物cDNA的长度，使PCR引物设计成为可能，从而实现PCR扩增，但是该方法由于仅识别靶标的3
’
端，对于5
’
端突变不能有效识别，检测特异性和灵敏度有待进一步加强，或由于空间位阻不利于cDNA形成，逆转录反应时间较长；茎环探针RT
‑
PCR法，设计一个茎环结构的检测探针，通过碱基互补配对，逆转录出靶标miRNA的5
’
端核苷酸序列，形成cDNA，通过PCR扩增实现miRNA的检测。该茎环探针通过增加空间构象，增强了检测的特异性，但是由于检测探针有双链结构，在用染料法检测时背景信号偏高，同样该方法也不能有效识别靶标5
’
端突变，存在检测特异性不足问题。最重要的一点是，无论是线性探针RT
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PCR法和茎环探针RT
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PCR方法，其逆转录反应需要比较长的时间(一般45分钟以上)，在核酸检测中存在明显应用限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种线性探针及利用其检测miRNA的方法，克服现有RT
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PCR检测miRNA方法中逆转录时间长、灵敏度或特异性不足等缺点。
[0006]本说明书所用术语“解离”是指双链核苷酸变为单链核苷酸的过程。
[0007]本说明书中所用术语“自身互补配对”是指寡核苷酸自身含有互补配对的核苷酸
序列，自身发生碱基互补配对。
[0008]本说明书所用术语“茎环”结构，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子内部的两个区域形成，其还包括至少一个“环”结构，即非互补的核苷酸分子(单链区域)。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：提供一种线性探针，所述线性探针至少包括a、b和c三个区域；所述b区域的3
’
端和a区域的5
’
端相连，所述c区域的3
’
端和b区域的5
’
端相连；所述a区域的核苷酸序列和靶标核酸互补配对，b区域的核苷酸序列可协助成环，c区域的核苷酸序列和靶标核酸5
’
端相同。
[0010]本专利技术线性探针的检测原理是：在有靶标存在时，线性探针a区域聚合延伸形成c*区，形成的a+c*区在反应温度下与靶标模板动态解离；探针延伸形成的c*区与探针原有序列c互补配对，在b区域核苷酸通过减少空间位阻协助成环，快速形成自身茎环结构的cDNA；同时靶标模板得到释放，循环参与下一轮cDNA反应，形成更多cDNA，所需逆转录时间更短，同时实现低浓度靶标有效逆转录；然后以cDNA为模板进行PCR扩增，实现靶标快速、灵敏特异检测。
[0011]本专利技术的线性探针在逆转录形成cDNA时，线性探针不仅识别靶标的3
’
端，同时也识别靶标的5
’
端，通过经历两次识别来增加检测特异性：首先线性探针的3
’
端与靶标识别配对(第一重识别)，聚合延伸出靶标的5
’
端(c*区)，聚合延伸的5
’
端(c*区)与线性探针c区域识别配对(第二重识别)，形成有具有环b+a的茎环结构的cDNA，作为后续PCR扩增模板；同时，靶标得到释放，循环参与逆转录反应，实现低丰度靶标逆转录，提高检测灵敏度。同时，由于b区域核苷酸序列通过减少空间位阻协助成环，快速形成茎环结构的cDNA，产生更多的茎环结构的cDNA，所需逆转录反应时间短。
[0012]作为本专利技术所述线性探针的优选实施方式，所述b区域是随机核苷酸序列，60≥核苷酸数目≥0，可通过调节GC含量，以使上下游引物退火温度相近。
[0013]更进一步的是，所述b区域是随机核苷酸序列，所述b区域核苷酸为10～40bp。
[0014]作为本专利技术所述线性探针的优选实施方式，所述靶标核酸包括RNA和DNA。
[0015]作为本专利技术所述线性探针的优选实施方式，所述线性探针还包括d区域；所述d区域的3
’
端与c区域的5
’
端相连；所述d区域是延长所述线性探针的核苷酸序列，所述d区域是随机核苷酸序列，通过调节GC含量，以使上下游引物退火温度相近。
[0016]本专利技术的线性探针不仅仅局限于a、b、c和d四个区域，也可含有多个协助成环的核苷酸序列和延长探针长度的核苷酸序列。
[0017]作为本专利技术所述线性探针的优选实施方式，所述d区域的5
’
端还可以包含c区域核苷酸序列。
[0018]本专利技术同时提供一种利用线性探针检测miRNA的方法，所述方法包括以下步骤：
[0019](1)采用所述的线性探针将靶标miRNA循环逆转录为cDNA；
[0020](2)以步骤(1)中得到的cDNA设计PCR引物，PCR扩增进行检测。
[0021]作为本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种线性探针，其特征在于：所述线性探针至少包括a、b和c三个区域；所述b区域的3
’
端和a区域的5
’
端相连，所述c区域的3
’
端和b区域的5
’
端相连；所述a区域的核苷酸序列和靶标核酸互补配对，b区域的核苷酸序列通过减少空间位阻协助成环，c区域的核苷酸序列和靶标核酸5
’
端相同。2.根据权利要求1所述的线性探针，其特征在于：所述b区域是随机核苷酸序列，通过调节GC含量，以使上下游引物退火温度相近。3.根据权利要求2所述的线性探针，其特征在于：所述b区域是随机核苷酸序列，核苷酸为0～60bp。4.根据权利要求3所述的线性探针，其特征在于：所述b区域核苷酸为10～40bp。5.根据权利要求1所述的线性探针，其特征在于：所述靶标核酸包括RNA和DNA。6.根据权利要求1所述的线性探针，其特征在于：所述线性探针还包括d区域；所述d区域的3
’
端与c区域的5
’
端相连；所述d区域是延长线性探针的核苷酸序列，所述d区域是随机核苷酸序列，通过调节GC含量，以使上下游引物退火温度相近。7.根据权利要求6所述的线性探针，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘孟坛，
申请(专利权)人：长沙智飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：