用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗对象中肿瘤的组合物，其包含治疗有效量的携带抑制量的靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒。其中，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法
本专利技术涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物，特别涉及包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤病毒的药物组合物。本专利技术还涉及一种包含携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒的药盒，以及使用所述药物组合物和所述药盒治疗肿瘤的方法。
技术介绍
癌症作为一种疾病是多方面的敌人，它可以屈服于指定的治疗方法，也可以对各种疗法产生抵抗力。肿瘤内的细胞子集对常规治疗方式有抵抗力，并且可以导致疾病复发。手术治疗癌症是常见的局部治疗。除了血液系统的某些恶性肿瘤（例如白血病，淋巴瘤等）外，其他各种恶性肿瘤还具有一种或多种可以通过手术移除的有形实体瘤。但是，手术总是有一定的风险，并且经常有其他并发症或潜在的器官功能障碍。迄今为止，非手术治疗癌症（主要是常规化学疗法、靶向生物疗法和放射疗法）尚未取得完全令人满意的结果。持续存在的问题包括靶标选择性低、耐药性、无法有效解决转移性疾病和严重的副作用。相反，目前整体上激发宿主免疫力来诱导针对肿瘤的全身反应的免疫疗法提供了许多临床前景。溶瘤病毒代表了一类新的治疗药物，其被设计为在癌细胞中选择性地复制并杀死癌细胞，使正常细胞免受其影响。众所周知，由于肿瘤相关抗原（TAA）、病原体相关分子模式（PAMPS）和危险相关分子模式（DAMPS）从裂解的肿瘤细胞释放，溶瘤病毒能够刺激对肿瘤细胞的适应性免疫反应。这些反应还将肿瘤从冷肿瘤（免疫沙漠型）转变为热肿瘤（免疫炎症型）。一旦被抗原呈递细胞（APC）处理，TAA然后能够诱导抗肿瘤T细胞反应与抗病毒反应同时发生。基于这些独特的特征，溶瘤病毒现在被认为是癌症免疫治疗剂。然而，仅溶瘤病毒治疗仍不能治愈体积大的和/或转移的肿瘤，因此溶瘤病毒还需要额外的治疗剂来增强其抗肿瘤作用。溶瘤病毒的另一个优势是能够被工程化以编码治疗基因，该基因能够进一步帮助该病毒的总体抗肿瘤功效。溶瘤病毒分为DNA病毒和RNA病毒。DNA病毒以腺病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒和牛痘病毒为主。RNA病毒包括呼肠孤病毒（reovirus）、柯萨基病毒（coxsackievirus）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）、塞内卡谷病毒（Senecavalleyvirus）、麻疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒等。理想的溶瘤病毒应该能够有效降低对患者和人群的风险。例如，溶瘤病毒对患者应该具有肿瘤选择性、正常组织非致病性、体内非持续性、遗传（基因）稳定性。除上述特征外，溶瘤病毒还应该是非传染性的，并且人群已经对该病毒具有广泛的免疫。尽管在临床前和临床环境中进行了广泛的研究和测试，但用于治疗肿瘤的方法仍然存在未满足的需求。概述一方面，本专利技术公开了一种携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体，其中外泌体包装相关的基序（下文中也指“外泌体基序”）被可操作地连接至靶向CTLA4的miRNA。在一个实施方案中，外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA，其中靶向CTLA4的miRNA具有结合CTLA4的mRNA的种子序列；并且外泌体基序与靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强靶向CTLA4的miRNA包装至外泌体中。在一些实施方案中，外泌体基序位于靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。在一些实施方案中，外泌体基序位于靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并通过连接子与其连接。在一些实施方案中，外泌体基序是通过突变靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。在一些实施方案中，外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序。在一些实施方案中，当可操作地连接时，靶向CTLA4的miRNA与外泌体基序共享至少一个或两个核苷酸。本专利技术的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体、治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。外泌体包含外泌体包装相关的基序，该基序任选地通过连接子可操作地连接至靶向CTLA4的miRNA。本专利技术的另一方面涉及一种用于治疗肿瘤的药盒，其包含携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒。药盒可以进一步包含使用外泌体和溶瘤病毒治疗肿瘤的说明。本专利技术的另一方面涉及一种用于治疗对象中的肿瘤的方法，该方法包含向该对象施用药学上有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体以及治疗有效量的溶瘤病毒。本专利技术的另一方面涉及一种用于在对象中增强溶瘤病毒疗法的功效的方法，除溶瘤病毒疗法外，该方法还包含向有此需要的对象施用治疗有效量的本专利技术的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。通过阅读下面的描述，将容易获得本专利技术的其他方面。附图说明图1。左图是编码靶向CTLA4的miRNA的质粒的示意图。右图示出了靶向小鼠CTLA4基因的miRNA（miR-CTLA4）的核苷酸序列。以粗体、斜体和下划线突出显示的核苷酸表示外泌体包装相关的基序（外泌体基序）。图2。设计的miRNA下调CTLA4。将接种在24孔板中的HEp-2细胞与0.25μg表达miR-CTLA4或非靶标miRNA（NT）的质粒和0.25μg编码His标记的小鼠CTLA4（mCTLA4-his）的质粒共转染。转染72小时后收获细胞，然后测量CTLA4和GAPDH的积累。图3。暴露于含有miR-CTLA4的外泌体的细胞中CTLA4蛋白的积累。用10μg选定的表达miR-CTLA4的质粒（1#、2#、3#和6#）转染HEp-2细胞（5x106）。孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次，以排除血清中外泌体的潜在污染，然后将细胞在不含胎牛血清（FBS）的培养基中再培养48小时。收集细胞上清液，并通过超速离心分离外泌体。将含有2.5x105HEp-2细胞的培养物与10μg纯化的外泌体孵育。孵育24小时后，将培养液替换为新鲜培养基。再过48小时后，收获细胞，将细胞裂解液在10％变性凝胶中电泳分离，并与所示抗体反应。图4。来自纯化外泌体的miR-CTLA4的分析。用10μg所示的编码靶向CLTA4的miRNA（miR-CTLA4-3#）的质粒转染HEp-2细胞，并纯化外泌体。从细胞沉淀和外泌体中提取RNA。使用实时PCR分析对miR-CTLA4进行定量并相对于18srRNA标准化。图5。表达鼠IL-12（mIL-12）的溶瘤病毒（T2850）及其原型野生型HSV-1（F）基因组的示意图。反向重复序列（b'a'和a'c'，IR）区域被mIL-12表达盒取代。图6。瘤内注射T2850和含有CTLA4miRNA的外泌体在同基因小鼠模型中抑制MFC和B16的肿瘤生长。将小鼠前胃癌MFC或小鼠黑色素瘤B16细胞分别皮下注射到615或C57BL/6J小鼠的右侧腹中。向平均80mm3的MFC肿瘤或平均70mm3的B16肿瘤肿瘤内注射50ml的PBS（含10％甘油（w/v））（对照）或1×107pfu混合有10μg外泌体的T2850，所述外泌体从非靶标（miRNA-NTex本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗对象中肿瘤的药物组合物，其包含：/n治疗有效量的外泌体，和/n治疗有效量的溶瘤病毒，/n其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于治疗对象中肿瘤的药物组合物，其包含：
治疗有效量的外泌体，和
治疗有效量的溶瘤病毒，
其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列包含SEQIDNO.1至SEQIDNO.4的核酸序列中的任何一个。


3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序为选自SEQIDNO.21至SEQIDNO.49的核酸序列。


4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。


5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序是通过突变所述靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。


6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序，其中所述两个单个外泌体基序中的任何一个是选自SEQIDNO.21至SEQIDNO.47的核酸序列。


7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述双倍基序具有SEQIDNO.48的核酸序列。


8.根据权利要求1所述的组合物，当可操作地连接时，其中所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序共享至少一个核苷酸或两个核苷酸或通过连接子连接。


9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述连接子由两个或更多个选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）的核苷酸组成。


10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述连接子是-GC-。


11.根据权利要求1所述的组合物，当可操作地连接时，其中所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序具有SEQIDNO.7的核酸序列。


12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、腺病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、任何这些病毒的突变株或任何这些病毒的基因工程株。


13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。


14.根据权利要求14所述的组合物，其中所述恶性肿瘤选自黑色素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。


15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述对象是人。


16.一种用于治疗对象中肿瘤的药盒，其包含：
（a）治疗有效量的外泌体，其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中，
（b）治疗有效量的溶瘤病毒，以及任选地
（c）使用说明。


17.根据权利要求16所述的药盒，其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列包含SEQIDNO.1至SEQIDNO.4的核酸序列中的任何一个。


18.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序是选自SEQIDNO.21至SEQIDNO.49的核酸序列。


19.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。


20.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序是通过突变所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓庆，周旭莎，伯纳德·罗兹曼，周国瑛，
申请(专利权)人：深圳市亦诺微医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44