一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到细胞株10B7，保藏编号为：CGMCC No.21904；步骤二、应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞；步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。该方法提高了犬瘟热病毒单克隆抗体的效价，无需浓缩，克服了传统腹水生产抗体的缺点，使抗体产品无杂蛋白，产品稳定，批间差异小。

【技术实现步骤摘要】
一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法
本专利技术属于微生物
，涉及一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法。
技术介绍
犬瘟热（caninedistemper）是犬瘟热病毒（caninedistempervirus，CDV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，常引起消化道、呼吸道以及神经系统症状，并能引起机体免疫抑制。该病的传染性极强，死亡率达80%以上，接种犬瘟热疫苗是预防犬瘟热最有效的途径之一。近年来，在广泛应用疫苗防治的同时，世界各地仍有犬感染犬瘟热病毒，并有范围内流行的报道。单克隆抗体由细胞工程产生的鼠源单克隆抗体，由单一B细胞克隆产生的高度均一，仅针对某一特定抗原表位的抗体。最大的特点是特异性强，纯度高，可扩大生产。目前为止，犬瘟热单克隆抗体的制备方法主要是小鼠腹腔收集，将单克隆抗体细胞注入BALB/c小鼠腹腔，细胞在内生长并产生腹水，7~10天后小鼠腹腔增大，收集腹水。此方法收集的抗体浓度高，但操作繁琐，产量低，无法规模化生产。而且收集的腹水中会有杂蛋白，需纯化并伴有污染动物病毒的危险。目前用生物反应器培养杂交瘤细胞可以规模化生产抗体并且避免动物病毒的危险。但是，生产后抗犬瘟热病毒单抗无法达到所需效价，需要进行浓缩，受温度、pH、料液浓缩倍数、经济成本等影响，急需研究出应用生物反应器生产抗犬瘟热病毒单克隆抗体且无需进行浓缩的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，该方法提高了犬瘟热病毒单克隆抗体的效价，无需浓缩，克服了传统腹水生产抗体的缺点，使抗体产品无杂蛋白，产品稳定，批间差异小。本专利技术应用的培养基成分明确，具有过程和质量可控、操作简单、生产效率高、稳定性好等优点。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，包括如下步骤：步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到成活率高、抗体分泌能力强的细胞株10B7，其中：所述杂交瘤细胞选自能够稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株，通过有限稀释克隆，挑选出可以稳定在无血清培养基悬浮培养的细胞株10B7，分类命名为杂交瘤细胞（hybridoma），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.21904，保藏日期为2021年2月25日；所述悬浮培养的具体步骤如下：待亚克隆挑选后的细胞株生长至单层，细胞密度按1.2E6接种于F125摇瓶内，每天取样计数，细胞密度按1.2E6传代，其中，培养基用法：接种摇瓶时用含15%血清的DMEM，每次传代用液DMEM（含15%血清）：无血清培养基的比例为1:3，1:1，3:1依次递减DMEM（含15%血清）用量；步骤二、应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段（即：培养细胞增殖）和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞，将收获的细胞液进行离心分离，无需浓度制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体成品；所述细胞生长阶段为以获得细胞数为主，抗体分泌阶段以持续稳定的获得大量分泌抗体为主；所述细胞生长阶段的培养条件：温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；所述抗体分泌阶段的培养条件：温度为34℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；所述生物反应器为搅拌式生物反应器；所述生物反应器培养细胞所用的培养基是无血清培养基，培养基分为两个部分：基础培养基和补料培养基；所述生物反应器内的培养方法为补料批次培养法；所述批次培养法为在生物反应器内放入罐体容积60%的培养基，细胞密度按1.0E6~1.2E6接种生物反应器，细胞在生物反应器内生长，一次性收获产品；所述补料批次培养法为在培养过程中补加补料培养基，其中：接种上罐的D1（接种当天为D0），细胞密度高于2.0E6，开始每日进行添加补料，补料添加量为培养体积的3%；所述生物反应器内的培养方式为单极培养法和/或逐级放大培养法；所述单极培养法为10L单极培养法，逐级放大培养法为10L-50L-200L逐级放大培养法；所述10L单级培养法以摇瓶培养细胞为种子细胞，将其接种到10L搅拌式生物反应器中进行培养，添加补料培养基，其中：细胞密度按1.0E6~1.2E6接种生物反应器，接种上罐的D1（接种当天为D0），细胞密度高于2.0E6，开始每日进行添加补料，补料添加量为培养体积的3%，培养D7，成活率低于40%，收集抗体；所述10L-50L-200L逐级放大培养法以10L生物反应器培养细胞为种子细胞，再将种子细胞放大到50L生物反应器中培养，再以50L生物反应器中培养的细胞作为种子细胞，将其放大到200L生物反应器进行培养，产生抗体，其中：细胞密度按1.0E6~1.2E6接种10L生物反应器，接种后体积为8L，接种上罐后的D2（接种当天为D0），细胞密度高于4.0E6，成活率高于90%，将8L细胞接种于50L生物反应器，接种后体积为33L，接种上罐后的D2（接种当天为D0），细胞密度高于4.0E6，成活率高于90%，将33L细胞接种于200L生物反应器，接种后体积为120L，接种上罐的D1（接种当天为D0），细胞密度高于2.0E6，开始每日进行添加补料，补料添加量为培养体积的3%，并产生抗体，培养D7，成活率低于40%，收集抗体；步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。为了清楚的表述本专利技术的保护范围，本专利技术对以下术语进行如下界定：本专利技术中的“交瘤细胞株”是将具有抗犬瘟热病毒单克隆抗体分泌的小鼠脾细胞和具有无限分裂的SP2/0细胞融合而成，所形成的杂交瘤细胞同时具有分泌抗体和无线增值的特性，包括但不限于本专利技术所举例的10B7细胞。本专利技术中涉及的基础培养基和补料培养基为无血清培养基，其包括但不限于本专利技术。相比于现有技术，本专利技术具有如下优点：1、本专利技术应用有限稀释法进行抗犬瘟热病毒细胞克隆，筛选出一株生长状态好、成活率高的细胞株并且可以稳定在无血清培养基内生长。2、本专利技术采用单极培养法或逐级放大培养法，生产过程自动化控制，收获的细胞培养液不需要浓缩即可达到所需效价，降低生产成本，提高产品质量。3、本专利技术应用生物反应器使用无血清悬浮培养杂交瘤细胞以制备抗犬瘟热病毒单克隆，不需要进行膜浓缩以能达到所需的抗体效价，该方法应用的无血清培养基成分明确，不使用牛血清，从而避免了血清中特异蛋白的残留，保证了产品质量。该培养基具有成分明确、生产过程和质量可控、抗体纯度高、稳定性好等优点。保藏信息：保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；保藏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株10B7，保藏编号为：CGMCCNo.21904。/n

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株10B7，保藏编号为：CGMCCNo.21904。


2.一种利用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到细胞株10B7；
步骤二、应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞；
步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。


3.根据权利要求2所述的用生物反应器制备犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤一中，悬浮培养的具体步骤如下：待亚克隆挑选后的细胞株生长至单层，细胞密度按1.2E6接种于F125摇瓶内，每天取样计数，细胞密度按1.2E6传代。


4.根据权利要求2所述的用生物反应器制...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶阳，宋新刚，张立恒，任德强，张健，孙博，麻昌姣，李兰，
申请(专利权)人：哈尔滨元亨生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23