本发明专利技术公开了一株由全基因合成的方法获得GPC3全长蛋白抗原免疫产生，可特异性地与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合的单克隆抗体，产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株和应用。本发明专利技术公开的单克隆抗体特异性高，灵敏度高，可检测到微量表达的GPC3蛋白，可以作为肝癌患者临床早期诊断的参考指标，可大量应用于临床检测和治疗。
【技术实现步骤摘要】
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，杂交瘤细胞株和应用
：本专利技术属于杂交瘤细胞株领域，具体地说涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)单克隆抗体，杂交瘤细胞株制备和单克隆抗体的应用。
技术介绍
：原发性肝癌(HCC)是全球常见恶性肿瘤之一，全世界每年超过78万人死于HCC，每年新发病例84万，我国HCC的发病率和病死率占全球的55％以上，且呈逐年上升趋势。对于早期的HCC患者，主要采用早期肝切除术，这是目前HCC治疗最有效的根治性手段。然而HCC起病隐匿，进展较快，很多患者在发现肿瘤时已经处于中晚期，丧失手术切除机会，而放射治疗、局部消融治疗、肝动脉化疗栓塞等治疗方法疗效有限，因此早期诊断和早期治疗是提高HCC患者生存率的关键。甲胎蛋白(AFP)是目前临床常用的肝癌特异性肿瘤标记物，然而，由于其灵敏度(39-64％)与特异性(76-91％)均有限，在部分慢性肝病和肝硬化患者，血清AFP水平也会升高，肝损伤和肝脏再生也能够增加非HCC患者血清AFP水平；近年来，异常凝血酶原(DCP，也称PIVKA-II)已被国内外指南列为肝癌检测极其重要的指标，但其特异性和敏感性仍然不足，而且在慢性肝炎和维生素K缺乏症也会轻度升高。因此寻找新的肝癌特异性标记物显得尤为重要。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族的一员，GPC3基因位于人类X染色体的26位，编码了580个氨基酸，分子量为66kD。研究显示，GPC3主要在滋养层和多种胚胎组织表达，在成人组织几乎不表达，当组织发生恶性转化时，GPC3mRNA和蛋白就会再次表达，尤其在肝癌组织中高表达，因此被看作新的肝癌标记物，可以作为HCC临床早期诊断的参考指标。目前，还有研究发现，GPC3可能成为新的HCC免疫治疗靶点，能够对肿瘤靶细胞进行特异性杀伤。目前，市场销售的GPC3抗体多数为进口产品，价格昂贵，更重要的是的特异性和敏感性较低，限制了其在临床诊断方面以及靶向治疗方面的应用。目前市场销售的GPC3抗体价格昂贵且在实验中用量大，如Abcam公司的重组GPC3抗体(货号ab207080)，免疫荧光检测使用浓度为1.136ug/ml，Westernblot检测使用浓度为0.568ug/ml,100ul价格高达4853元。正因为如些，难以大规模应用。中国专利201210086014.0与201210086009.X公布了GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6与7D11及其制备方法和应用，其中进行免疫荧光实验抗体需进行1:10稀释，说明抗体用量大灵敏度不足。中国专利201510097025.2是用GPC3人工半抗原作为免疫原制备GPC3单克隆抗体的，中国专利201110033378.8是用GPC3-C端蛋白作为免疫原制备GPC3单克隆抗体的，中国专利201410767938.6是用GPC3蛋白片段作为免疫原制备GPC3单克隆抗体的。上述专利的GPC3选取抗原不同，敏感性参差不齐，灵敏度差，重复性差。专利技术
技术实现思路
：本专利技术的一个目的是提供高度灵敏性的单克隆抗体，该抗体由采用密码子优化及全基因合成的方法获得GPC3全长蛋白抗原免疫产生，可特异性地与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合。本专利技术的另一个目的是提供产生的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可分泌抗GPC3蛋白的单克隆抗体，此抗体高度灵敏，重复性好。本专利技术的第三个目的是制备分泌GPC3抗体的杂交瘤细胞株的方法。本专利技术的第四个目的是制备抗GPC3的单克隆抗体的方法。本专利技术的再一个目的是抗GPC3的单克隆抗体的应用。本专利技术公开了一株由核苷酸序列为SEQSEQIDNO:1表达的重组GPC3蛋白免疫产生的小鼠杂交瘤细胞株GPC3-T，该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C2020109。本专利技术公开的杂交瘤细胞株是抗GPC3蛋白的杂交瘤细胞株，本专利技术公开的作为免疫源使用的GPC3蛋白是由核苷酸序列为SEQIDNO:1表达产生的，是采用密码子优化及全基因合成的方法获得GPC3全长蛋白抗原，将其作为免疫原制备GPC3单克隆抗体，杂交瘤细胞是通过重组GPC3蛋白免疫小鼠脾细胞，再由免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得。本专利技术公开了在真核生物中表达制备纯化GPC3蛋白的方法。本专利技术的GPC3全长蛋白抗原是采用密码子优化及全基因合成的方法获得GPC3全长蛋白抗原，将其作为免疫原制备GPC3单克隆抗体。GPC3蛋白具体的制备过程如下:1.引物设计与合成根据基因GPC3序列及重叠PCR原理设计引物，序列见表1，引物序列特征为：编号为单号的引物与GPC3基因序列(5'->3')方向一致，编号为双号的引物与GPC3基因序列(5'->3')反向互补，另外相邻编号的序列之间存在17bp重叠。第一条序列的前10bp为保护碱基。最后一条序列的后10bp为保护碱基。表1引物列表待引物合成后用去离子水稀释至50pmol/μl，适当离心混合均匀。2.基因扩增在冰上按表2配制反应体系，混匀后放入PCR仪，44条引物的相邻引物之间有17bp反向互补，每条引物中间有21bp左右未互补序列，44条引物涵盖了GPC3基因的全长。将44条引物混合后经过退火处理(55℃，1min)，相邻引物的17bp序列互补配对。中间未配对的21bp左右序列，在高保真酶的作用下序列被补齐，从而构成完整的双链GPC3基因的全长序列。在PCR仪上经过25个循环扩增，GPC3基因得到扩增，PCR扩增程序见表3。表2PCR扩增反应体系表3PCR扩增反应条件3.扩增片段的电泳检测以及回收PCR扩增后利用1.5％琼脂糖电泳30min，然后比照DNAmarker大小，在紫外灯下回收目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的基因GPC3条带。4.载体与目的基因的酶切表4酶切体系将回收的GPC3基因片段和pATX2载体分别按上述表4准备反应体系，然后在37℃酶切1-2h；将酶切产物利用1.5％的琼脂糖电泳检测并利用胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段和载体片段。5.载体与目的基因的连接：将酶切后的载体片段与GPC3基因片段按如下体系配制反应体系表5，并放于16℃连接1h。表5连接体系6.转化将要经T4连接酶连接后的产品加入到装有TOP10感受态细胞的管中，50μl感受态细胞需要25ngDNA，体积应不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min。将离心管混合物放入加温至42℃的循环水中，热激90s，不要摇动管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入200μlSOC液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。将适当体积(每个90mm平板达200μl)已转化的感受态细胞转移到本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株由核苷酸序列为SEQ SEQ ID NO:1表达的重组GPC3蛋白免疫产生的小鼠杂交瘤细胞株GPC3-T，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2020109。/n
【技术特征摘要】
1.一株由核苷酸序列为SEQSEQIDNO:1表达的重组GPC3蛋白免疫产生的小鼠杂交瘤细胞株GPC3-T，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C2020109。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是抗GPC3蛋白的杂交瘤细胞株，所述GPC3蛋白为真核生物表达的重组GPC3蛋白，由核苷酸序列为SEQIDNO:1表达产生的。
3.一种抗GPC3的单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌所得，属于IgG亚型,能特异性地识别GPC3蛋白，并与GPC3阳性肝癌细胞系具有强反应性。
4.权利要求3所述的抗GPC3的单克隆抗体，其特征在于，该抗体是鼠源抗体，重链可变区的CDR1具有SEQIDNO:46所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQIDNO:47所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQIDNO:48所示的氨基酸序列；轻链可变区CDR1具有SEQIDNO:53所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQIDNO:54所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQIDNO:55所示的氨基酸序列。
5.权利要求3所述的抗GPC3的单克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤的药物制剂中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：孟忠吉，贺昱霖，曾少波，
申请(专利权)人：十堰市太和医院湖北医药学院附属医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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