一种杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株可分泌番茄斑萎病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用于制备免疫金标速测卡，其方法如下，步骤1、对番茄斑萎病毒重组蛋白进行纯化，步骤2、将纯化的番茄斑萎病毒重组蛋白免疫兔，获得多克隆抗体，步骤3、将纯化的番茄斑萎病毒重组蛋白免疫小鼠，然后通过细胞融合、克隆化筛选制备得到该单克隆抗体，最后制备小鼠腹水，经过纯化得到鼠抗番茄斑萎病毒单克隆抗体，步骤4、通过配对筛选，得到配对的单克隆抗体和多克隆抗体用于所述免疫金标速测卡，借此，本发明专利技术具有可将该免疫金标速测卡应用于番茄斑萎病毒进行快速、现场和灵敏的检测的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术属于番茄斑萎病毒
，特别涉及一种杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
番茄斑萎病毒(TSWV)的粒子呈球型，直径约85am，表面包裹有一层膜，膜外层由突起层组成，突起层厚5nm，几乎连续。该病毒共有4种结构蛋白，包括：糖蛋白G1，其分子质量为78.0kDa；糖蛋白G2，其分子质量为58.0kDa；蛋白L，分子质量为200.0kDa；外壳蛋白N，其分子质量为28.8kDa。粒子重量的20％～30％为脂类，粒子重量的7％为碳水化合物，病毒包裹3分子线形ssRNA，其基因组长约16600nt，核酸占病毒粒子总重量的1％～2％，各基因组RNA均由核衣壳蛋白(N)包被，形成拟核衣壳结构，每一双层膜结构内包被3个核衣壳。大的RNA片段(L)为8897nt，编码RNA聚合酶(331kD)，小RNA片段(S，2916nt)和中等大小RNA片段(M，4821nt)以反义方式排列，小RNA编码核衣壳蛋白(30kD)及非结构蛋白(NS)，mRNA的互补链编码G1和G2的前蛋白和一种非结构蛋白(NS)，病毒链编码运动蛋白(M，33.6kD)。粗汁液钝化温度为40～46℃(10min)，稀释限点为2×10-3～2×10-2，离体病毒的体外存活期为室温下2～5h。番茄斑萎病毒的寄主范围广泛，包括30多科双子叶植物和7科单子叶植物的100多种植物可自然感病，汁液接种可传播50多科300多种植物。茄科、葫芦科、菊科和豆科植物都受害严重。其重要的寄主植物很多，主要经济作物有烟草、马铃薯、番茄、茄、花生、辣椒等。该病毒同时可感染一些常见的杂草，如三叶鬼针草、蒲公英等；系统侵染的寄主有番茄、百日草、烟草和莴苣等；局部侵染的寄主有矮牵牛、心叶烟及黄瓜等。据报道，该病毒能引起严重的经济损失，番茄斑萎病毒侵染70科900多种植物，包括粮食、烟草、蔬菜及花卉，因此受到国际植物病理学界的重视。既使是在同一寄主植物上，因品种、年龄、营养状况和环境条件的不同，番茄斑萎病毒的危害症状也会有很大差异。目前常规检测TSWV的方法为PCR，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，但针对茄科、豆科、十字花科、菊科和葫芦科等作物上病毒检测较少。
技术实现思路
本专利技术提出一种杂交瘤细胞株及其应用，能够分泌番茄斑萎病毒的单克隆抗体，并将其应用于检测试剂盒和免疫金标速测卡。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCCNO:C202055。一种番茄斑萎病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体由杂交瘤细胞株产生，单克隆抗体亚型为IgG1，轻链类型为κ。一种检测试剂盒，该检测试剂盒内包杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体，所述检测试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光检测试剂盒中的一种。一种免疫金标速测卡，包括标记垫和与标记垫相搭接的层析膜，标记垫含有被胶体金标记的权利要求2所述的单克隆抗体，层析膜上的检测线含有番茄斑萎病毒多克隆抗体，层析膜上的控制线含有羊抗鼠IgG二抗。作为一种优选的实施方式，其制备方法如下：步骤1、对番茄斑萎病毒重组蛋白进行纯化；步骤2、将纯化的番茄斑萎病毒重组蛋白免疫兔，获得多克隆抗体；步骤3、将纯化的番茄斑萎病毒重组蛋白免疫小鼠，然后通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体细胞株，最后制备小鼠腹水，经过纯化得到鼠抗番茄斑萎病毒单克隆抗体；步骤4、通过配对筛选，得到配对的单克隆抗体和多克隆抗体用于所述免疫金标速测卡。作为一种优选的实施方式，标记垫上单克隆抗体的量为5ng-50ng，层析膜上多克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg。作为一种优选的实施方式，步骤1中进行纯化的方法如下：步骤5、选取病毒目标蛋白合成基因序列，并按照基因序列，合成原核表达载体pET-30a-TSWV，转化BL21与Rosetta；步骤6、固体平板上挑取pET30a-TSWV单克隆菌落接入LB液体培养基，37℃培养12h-14h；步骤7、次日，将步骤6中的菌种以1：50接入LB液体培养基，37℃培养至OD＝0.4-0.6，加入IPTG，20℃-30℃诱导表达3h-7h后菌液离心，收集菌体；步骤8、将步骤7中的菌体进行超声波裂解，收集上清液和沉淀；步骤9、将步骤8中的上清液利用树脂进行纯化，并用咪唑洗脱，收集洗脱液后透析去除咪唑，得到纯化后的番茄斑萎病毒重组蛋白。作为一种优选的实施方式，步骤2中多克隆抗体的制备方法如下：步骤10、将纯化后的番茄斑萎病毒重组蛋白和等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，呈油包水状态，以备免疫兔；步骤11、将番茄斑萎病毒重组蛋白免疫兔，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测；步骤12、将免疫兔血清离心后取上清液，在搅拌的条件下加入饱和硫酸铵，继续搅拌后离心，取沉淀后溶于PBS，并透析过夜；步骤13、将步骤12中的沉淀采用ProteinG小柱进行传话，并保持PH呈中性，即得到多克隆抗体。作为一种优选的实施方式，步骤3中单克隆抗体的制备方法如下：步骤14、将纯化后的番茄斑萎病毒重组蛋白和等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，呈油包水状态，以备免疫小鼠；步骤15、将番茄斑萎病毒重组蛋白免疫兔，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测；步骤16、最后一次免疫后2周，腹腔注射抗原进行加强免疫，3天后进行细胞融合；步骤17、将融合好的细胞铺进孔板，用HAT培养液进行培养，3天后换液，改用HT培养液培养；步骤18、使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株；步骤19、提前1周在小鼠腹腔注射矿物油，将细胞株注射入小鼠腹腔后收集腹水，离心后所得上清即为单克隆抗体腹水；步骤20、将步骤19中的腹水离心后取上清液，在搅拌的条件下加入饱和硫酸铵，继续搅拌后离心，取沉淀后溶于PBS，并透析过夜；步骤21、将步骤20中的沉淀采用ProteinG小柱进行传话，并保持PH呈中性，即得到单克隆抗体。作为一种优选的实施方式，该免疫金标速测卡的检测方法如下：步骤22、加入待检样本；步骤23、当样本中含有待检测物质时，检测线和控制线显色，当样本中不含有待检测物质时，检测线不显色，控制线显色。采用了上述技术方案后，本专利技术的有益效果是：本专利技术筛选到一株杂交瘤细胞，能够分泌番茄斑萎病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体的灵敏度高，特异性强，效价高，具有良好的稳定性。本专利技术提供的免疫金标速测卡可以应用于番茄斑萎病毒进行快速、现场和灵敏的检测。本专利技术免疫金标速测卡主要应用于叶片样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:C202055。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCCNO:C202055。


2.一种番茄斑萎病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生，其特征在于，所述单克隆抗体亚型为IgG1，轻链类型为κ。


3.一种检测试剂盒，该检测试剂盒内包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述检测试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光检测试剂盒中的一种。


4.一种免疫金标速测卡，包括标记垫和与标记垫相搭接的层析膜，其特征在于，所述标记垫含有被胶体金标记的权利要求2所述的单克隆抗体，所述层析膜上的检测线含有番茄斑萎病毒多克隆抗体，所述层析膜上的控制线含有羊抗鼠IgG二抗。


5.根据权利要求4所述的免疫金标速测卡，其特征在于，其制备方法如下：
步骤1、对番茄斑萎病毒重组蛋白进行纯化；
步骤2、将纯化的番茄斑萎病毒重组蛋白免疫兔，获得多克隆抗体；
步骤3、将纯化的番茄斑萎病毒重组蛋白免疫小鼠，然后通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体细胞株，最后制备小鼠腹水，经过纯化得到鼠抗番茄斑萎病毒单克隆抗体；
步骤4、通过配对筛选，得到配对的单克隆抗体和多克隆抗体用于所述免疫金标速测卡。


6.根据权利要求4所述的免疫金标速测卡，其特征在于，所述标记垫上单克隆抗体的量为5ng-50ng，层析膜上多克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg。


7.根据权利要求5所述的免疫金标速测卡，其特征在于，所述步骤1中进行纯化的方法如下：
步骤5、选取病毒目标蛋白合成基因序列，并按照基因序列，合成原核表达载体pET-30a-TSWV，转化BL21与Rosetta；
步骤6、固体平板上挑取pET30a-TSWV单克隆菌落接入LB液体培养基，37℃培养12h-14h；
步骤7、次日，将步骤6中的菌种以1：50接入LB液体培养基，37℃培养至OD＝0.4-0.6，加入IPTG，20℃-30℃诱导表达3h-7h后菌液离心，收集菌体；
步骤8、将步骤7中的菌体进行超声波裂解，收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金广，余艳璧，王凤龙，夏振远，黄坤，李莹，申莉莉，刘春明，蔺忠龙，谢永辉，张立猛，杨海林，王志江，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，云南省烟草农业科学研究院，云南省烟草公司红河州公司，云南省烟草公司昆明市公司，云南省烟草公司玉溪市公司，
类型：发明
国别省市：山东;37