一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术的分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19180。所述杂交瘤细胞株ABC07分泌产生对霜霉威具有较好亲和力和较高灵敏度的单克隆抗体，对霜霉威的50%抑制浓度IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
霜霉威是一种高效、广谱、安全的氨基甲酸酯类杀菌剂，属于内吸性杀菌剂，适用于叶面处理和土壤处理、种子处理。对藻状菌的真菌有效。例如，丝囊霉、盘梗霉、霜霉、疫霉、假霜霉、腐霉等真菌所致病害均有防治作用，对植物有刺激生长作用。对防治农作物，特别是蔬菜、果树的霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病、黑痉病有良好的效果。有关霜霉威药物残留在动物组织中的检测方法，国内外已有少量报道，主要是用高效液相色谱～荧光检测器检测法及液相色谱一串联质谱法。提取的方法也各有不同，有液—液萃取、液—固萃取等。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本专利技术的目的在于提供一种对霜霉威具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对霜霉威具有较好的亲和力和灵敏度，可以用来建立霜霉威酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法。本专利技术的技术方案：一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.19180，保藏日期2019年11月28日，分类命名：单克隆细胞株。霜霉威单克隆抗体，其是由保藏编号CGMCCNo.19180的杂交瘤细胞株ABC07分泌产生。所述霜霉威单克隆抗体的应用，用于食品中霜霉威残留的检测。本专利技术提供的ABC07细胞株的制备基本步骤为：（1）半抗原的合成：通过4-(2-溴乙基)苯甲酸，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷与氯甲酸丙酯反应从而衍生出苯环和羧基，以便于连接载体蛋白。霜霉威半抗原的制备方法，将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷和K2CO3在DMF中的混合物搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；将化合物2和TEA在DMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯；将反应混合物在室温搅拌过夜，将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。进一步地，步骤如下：将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸2.0g、8.73mmol，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷8.90g、87.3mmol和K2CO32.42g、17.5mmol在40mLDMF中的混合物在50℃下搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；在0℃下，将化合物210.0g、8.73mmol和TEA13.2g、131mmol在200mLDMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯21.5g、175mmol；将反应混合物在室温搅拌过夜；将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。（2）免疫原的制备与鉴定：以霜霉威衍生物为原料，通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；霜霉威免疫原的制备方法，取霜霉威半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化；另取牛血清蛋白BSA溶解于碳酸盐缓冲溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析，分装保存。进一步地，步骤如下：取4.5mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和3.7mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化6h；另取15mg牛血清蛋白BSA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。霜霉威包被原的制备方法，取霜霉威半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌活化；另取OVA溶解于碳酸盐缓冲溶液溶液CBS中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析，分装保存。进一步地，步骤为：取3mg上述霜霉威半抗原，再加入5.0mgEDC和3.7mgNHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mgOVA溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CBS溶液中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。（3）小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐剂，剂量为100μL/只，加强免疫使用福氏不完全佐剂，剂量为50μL/只，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，剂量为25μL/只，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株ABC07；（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗IgG类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术获得的霜霉威单克隆抗体，对霜霉威有较好的检测灵敏度和亲和力；（2）一种新的合成霜霉威半抗原和免疫原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。附图说明图1是免疫原的紫外吸收光谱表征。图2是霜霉威单克隆抗体的标准抑制曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将霜霉威完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对霜霉威有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1：霜霉威单克隆抗体杂交瘤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.19180，保藏日期2019年11月28日，分类命名单克隆细胞株。/n

【技术特征摘要】
1.一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.19180，保藏日期2019年11月28日，分类命名单克隆细胞株。


2.霜霉威单克隆抗体，其特征在于：其是由保藏编号CGMCCNo.19180的杂交瘤细胞株ABC07分泌产生。


3.霜霉威半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：
将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷和K2CO3在DMF中的混合物搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；
将化合物2和TEA在DMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯；将反应混合物在室温搅拌过夜，将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。


4.根据权利要求3所述霜霉威半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：
将化合物1：4-(2-溴乙基)苯甲酸2.0g、8.73mmol，N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷8.90g、87.3mmol和K2CO32.42g、17.5mmol在40mLDMF中的混合物在50℃下搅拌过夜，将反应混合物冷却至室温；浓缩混合物，得到粗产物化合物2，为白色固体；
在0℃下，将化合物210.0g、8.73mmol和TEA13.2g、131mmol在200mLDMF中的溶液中加入碳酰氯丙基酯21.5g、175mmol；将反应混合物在室温搅拌过夜；将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化两次，得到黄色油状物霜霉威衍生物，即为霜霉威半抗原。


5.霜霉威免疫原的制备方法，其特征在于：取霜霉威半抗原，再加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，刘杰，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，吴爱红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32