一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一种分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19181。利用该细胞株分泌获得异噁草酮单克隆抗体用于进行食品安全检测中异噁草酮残留的分析检测。本发明专利技术获得的异噁草酮单克隆抗体可用于免疫分析检测，其对异噁草酮有较好的检测灵敏度和特异性（IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
异噁草酮（clomazone，简称CLO），又称异噁草松，国外商品名为广灭灵，是一种选择性芽前除草剂。其施用后会被植物的根、幼芽吸收，随蒸腾作用向上传导到植物的各个部位，敏感植物叶绿素的生物合成会受抑制，虽然能萌芽出土，但无色素，白化，在短期内死亡，而大豆等耐药性植物吸收后能通过代谢作用，将其转化为无杀草能力的降解产物，使自身免受其害。因此，其广泛应用于大豆田、水稻田、甘蔗田及烟草田等来防除阔叶杂草和禾本科杂草。但其属长残留性除草剂，半衰期约为24d，在土壤中的生物活性可持续6个月以上，易对后茬小麦、向日葵等作物及多种蔬菜造成药害残留，并且有研究表明其对哺乳动物的基因具有潜在的致突变性，会增加癌症风险，因此国标中对其最低残留量做出了明确规定，要求其最低检测线为10ng/mL。异噁草酮含量分析方法有：高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点。因此建立快速简便的异噁草酮检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为异噁草酮检测提供了一种新的检测途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株分泌抗异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株分泌的抗体针对异噁草酮具有较高的检测灵敏度，可以用来建立异噁草酮的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19181。异噁草酮单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.19181的杂交瘤细胞株ABC06分泌产生。所述异噁草酮单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中异噁草酮残留量的分析检测。本专利技术提供的分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06的制备基本步骤为：（1）异噁草酮半抗原的制备：将26μL浓硝酸溶于100μL浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取100mg异噁草酮溶于325μL浓硫酸，4℃搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液，-10℃反应7h；恢复至0℃，加入2mL冰水，逐滴加入浓氨水调节pH至4.8-5.2，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO-NO2；取50mgCLO-NO2溶于乙醇/醋酸/水（体积比2:2:1）混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入20mg锌粉和3μL浓盐酸，60℃加热回流15min，室温搅拌40min，由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到半抗原CLO-NH2，半抗原合成路线见杂交瘤细胞株ABC06的制备；（2）异噁草酮完全抗原的制备：采用碳二亚胺法将半抗原CLO-NH2分别与载体蛋白BSA及OVA偶联制备免疫原异噁草酮-BSA和包被原异噁草酮-OVA，通过透析分离完全抗原与未偶联的半抗原CLO-NH2；（3）小鼠的免疫：将免疫原异噁草酮-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用异噁草酮-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株ABC06；（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的杂交瘤细胞株ABC06分泌的单克隆抗体，对异噁草酮具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为5.5ng/mL），可实现对谷物、油料、蔬菜、糖料、烟草中异噁草酮残留量的检测，为食品中异噁草酮残留的免疫学检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏:一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19181。附图说明图1ABC06分泌的单克隆抗体对异噁草酮的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或规范。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将异噁草酮完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过icELISA筛选细胞上清，最终得到了对异噁草酮有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC06。实施例1杂交瘤细胞株ABC06的制备1、完全抗原的制备（1）半抗原的合成，反应方程式如下式所示：衍生步骤简述如下：异噁草酮半抗原的制备：将26μL浓硝酸溶于100μL浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取100mg异噁草酮溶于325μL浓硫酸，4℃搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液，-10℃反应7h；恢复至0℃，加入2mL冰水，逐滴加入浓氨水调节pH至4.8-5.2，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO-NO2；取50mgCLO-NO2溶于乙醇/醋酸/水（体积比2:2:1）混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入20mg锌粉和3μL浓盐酸，60℃加热回流15min，室温搅拌40min，由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到半抗原CLO-NH2；（2）免疫原异噁草酮-BSA的制备：称取3.4mg已制备的CLO-NH2，溶于200μLDMF中，搅拌下依次加入4.6mgN-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4h，得到的混合物称为A液；然后称取10mg牛血清蛋白BSA溶于2mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12h，用0.01mol/L磷酸缓冲液PBS透析3d，即得偶联物异噁草酮-BSA，-20℃冻存备用；2、包被原的制备：称取1.7mg巳制备的CLO-NH2，溶于200μLDMF中，搅拌下依次加入2.3mgN-羟基琥珀酰亚胺和3.4mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4h，得到的混合物称本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19181。/n

【技术特征摘要】
1.一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19181。


2.异噁草酮单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.19181的杂交瘤细胞株ABC06分泌产生。


3.异噁草酮半抗原的制备方法，其特征在于：将浓硝酸溶于浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取异噁草酮溶于浓硫酸，搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液低温反应；加入冰水，逐滴加入浓氨水调节pH，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO-NO2；取CLO-NO2溶于乙醇、醋酸和水的混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入锌粉和浓盐酸，加热回流，室温搅拌反应，反应液由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到产物异噁草酮半抗原CLO-NH2。


4.根据权利要求3所述异噁草酮半抗原的制备方法，其特征于步骤如下：将26μL浓硝酸溶于100μL浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取100mg异噁草酮溶于325μL浓硫酸，4℃搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液，-10℃反应7h；恢复至0℃，加入2mL冰水，逐滴加入浓氨水调节pH至4.8-5.2，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO-NO2；取50mgCLO-NO2溶于乙醇/醋酸/水体积比2:2:1的混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入20mg锌粉和3μL浓盐酸，60℃加热回流15min，室温搅拌40min，由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到产物异噁草酮半抗原CLO-NH2。


5.异噁草酮完全抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）免疫原异...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，王鹏，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，吴爱红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32