一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用，所述试剂盒中包含荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象，所制备的荧光抗体具有特异性，该荧光抗体的最适工作浓度确定为1:480。相比于对照荧光抗体而言，本发明专利技术的荧光抗体具备优越的检测特异性和灵敏性，在CPV病毒浓度为0.390625

【技术实现步骤摘要】
一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及犬细小病毒检测
，更具体地，涉及一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）是细小病毒科细小病毒属成员，单链小 DNA 病毒，在 1977 年首先在美国被发现的，1978 年首次从患有肠炎的病犬体内分离获得该病毒，随后在世界各地的犬科动物中相继被发现。病犬以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少和病死率较高为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎。本病发病率和死亡率为均很高，对养犬业、经济动物养殖业危害很大，也威胁到了野生动物的生存。
[0003]犬细小病毒病的诊断包括临床诊断和实验室诊断，临床诊断首先根据发病迅速，传染性强，往往呈局部暴发性等流行病学调查结果，再结合临床表现症状如呕吐、脱水、腹泻等肠炎综合征，并且排出的稀粪恶臭带血，最后结合病理剖检结果可怀疑是 CPV 感染。但本病与犬冠状病毒病、轮状病毒病、细菌性肠炎等病临床症状相近似，只有实验室做病原诊断才能确诊。
[0004]近年来国内外有关犬细小病毒病实验室诊断技术包括常用的 CPV 抗原的检测方法有动物感染试验、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验、病毒分离（VI）、电镜（EM）与免疫电镜（ME）、免疫色谱法（IC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、免疫荧光试验（FA）、核酸探针检测等。但是这些方法存在特异性差、灵敏度低、耗时长、操作繁琐等不足之处，不便于实现现场检疫。
[0005]因此，开发一种新的检测方法，快速、敏感、特异、准确地检测犬细小病毒对该疾病预防和治疗具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种犬细小病毒检测试剂盒及其应用。本研究以纯化的犬细小病毒单克隆抗体制备荧光抗体，对该荧光抗体的检测效果进行鉴定。并用该荧光抗体建立了 CPV 抗原的直接免疫荧光检测方法。
[0007]具体而言，本专利技术首先是提供了一种犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]优选地，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其序列分别对应于SEQ ID NO.3
‑
5所示，所述犬细小病毒单克隆抗体轻链可变区包括CDR4、CDR5和CDR6，其序列分别对应于SEQ ID NO.6
‑
8；进一步地，本专利技术还提供了一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，采用荧光基团标记所述犬细小病毒单克隆抗体，其中所述犬细小病毒单克隆抗体的轻链CDR4
‑
6分别如SEQ ID NO.6
‑
8所示，所述单克隆抗体的重链CDR1
‑
3分别如SEQ DI NO.3
‑
5所示。
SP2/0 骨髓瘤细胞回收，1000r/min 离心 5min，用 1640不完全培养液悬浮，重复洗 2 次，最后用 10mL 1640不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
[0022]取加强免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中 5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有 10mL 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有 10mL 不完全培养基的平皿中，用 5mL 的注射器吸取培养液反复吹打脾，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基，制成脾细胞悬液。用移液器将悬液移入小试管中。直立小试管 3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。用 1640 不完全培养液洗涤细胞两次（1000rpm，5min），10mL 1640 不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
[0023]将已制备好的 SP2/0 骨髓瘤细胞及脾细胞混合于灭菌的 50mL 圆筒离心管内，两种细胞之比为 1:10，1200rpm 离心 8min，去上清，轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于 40℃水浴中，使其达融合温度。将离心管倾斜，1min 内加入 40℃预热的 50% PEG（分子量 4000)边加边轻微摇动。40℃水浴作用 1min 后迅速 700rpm 离心 3min。加 37℃预温的不完全培养液以终止 PEG 作用，每隔 1min分别加入 1ml、1ml、1ml、1ml、10ml。1000rpm 离心 5min，同样的方法再洗涤一次，以彻底去除 PEG。弃上清，沉淀细胞用 HAT 培养液重悬。将上述细胞加入前日铺有饲养细胞的 96 孔板中，100μL/孔，将培养板放置 37℃ 5%的 CO2培养箱中培养。 融合后第 3、6、9 日换入含 HAT 的完全 1640 培养液。换液方法为每孔吸去200μL 培养液上清，然后加入 200μL 新鲜的 HAT 培养液，注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出。于第 10、12 日换液时改用含有 HT 的完全 1640 培养液。仔细观察细胞的生长情况，凡有污染的孔立即滴加 1%的 NaOH，以免污染扩散。温度及 CO2浓度的改变会影响到融合细胞的生长，所以细胞融合后的 1~2d内不宜把培养板从培养箱内拿出长时间的观察。每次换液前首次换液前用倒置显微镜观察细胞的生长、死亡状况。在融合后的第 3d，可见瘤细胞基本破碎消失，在巨噬细胞周围聚集着大量的细胞碎片，少数细胞浑圆透亮，呈葡萄状，形成集落，形似骨髓瘤细胞。集落间细胞数目不等，而且细胞数增长很快。一般 1 个孔里有一个细胞集落，但也有的孔里有两个以上的细胞集落。融合细胞集落生长速度很快，生长快的，6~7d 就能布满培养孔的面积 1/5~1/2，此时可取上清进行抗体检测。一般在 10d 左右检测，两周以上未长出融合细胞的细胞孔应放弃。
[0024]1.2杂交瘤细胞系筛选
[0025]用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞（长至孔底的1/2以上）分泌抗体的情况，以筛选出阳性细胞株。具体方法为取杂交瘤细胞培养上清200μL加入前日包被好的酶标板孔中，同时设立阳性、阴性对照和空白对照。判定标准为OD
490
值阳性孔与对照孔比值≥2.1判定为阳性。阴性孔3d后再检测一次，如仍为阴性则弃之。
[0026]1.3单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定
[0027]取杂交瘤细胞株培养上清，采用IsoStrip Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping试剂盒(Roche公司)测定抗体重链、轻链类型。
[0028]经鉴定，本专利技术所述犬细小病毒单克隆抗体MAb16的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。所述犬细小病毒单克隆抗体重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括包含荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其序列分别对应于SEQ ID NO.3
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5所示。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒单克隆抗体轻链可变区包括CDR4、CDR5和CDR6，其序列分别对应于SEQ ID NO.6
‑
8。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为FITC、FAM、Rhodamine B、TAMRA、Cy3、Cy5荧光基团标记。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为FITC荧光基团标记。6. 一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋新刚，任德强，张萌萌，刘冠宇，王洪伟，麻昌姣，张健，叶阳，牛梦雨，王力贺，张爽，
申请(专利权)人：哈尔滨元亨生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：