一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用，所述单抗是针对CPV的特异性抗体，其与CDV、RV、CAV和CCV均不发生交叉反应。经鉴定，所述单克隆抗体的轻链CDR1

【技术实现步骤摘要】
一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及犬细小病毒检测
，更具体地，涉及一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）是细小病毒科细小病毒属成员，单链小 DNA 病毒，在 1977 年首先在美国被发现的，1978 年首次从患有肠炎的病犬体内分离获得该病毒，随后在世界各地的犬科动物中相继被发现。病犬以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少和病死率较高为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎。本病发病率和死亡率为均很高，对养犬业、经济动物养殖业危害很大，也威胁到了野生动物的生存。
[0003]犬细小病毒病的诊断包括临床诊断和实验室诊断，临床诊断首先根据发病迅速，传染性强，往往呈局部暴发性等流行病学调查结果，再结合临床表现症状如呕吐、脱水、腹泻等肠炎综合征，并且排出的稀粪恶臭带血，最后结合病理剖检结果可怀疑是 CPV 感染。但本病与犬冠状病毒病、轮状病毒病、细菌性肠炎等病临床症状相近似，只有实验室作病原诊断才能确诊。
[0004]近年来国内外有关犬细小病毒病实验室诊断技术包括常用的 CPV 抗原的检测方法有动物感染试验、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验、病毒分离（VI）、电镜（EM）与免疫电镜（ME）、免疫色谱法（IC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、免疫荧光试验（FA）、核酸探针检测等。但是这些方法存在特异性差、灵敏度低、耗时长、操作繁琐等不足之处，不便于实现现场检疫。
[0005]因此，开发一种新的检测方法，快速、敏感、特异、准确地检测犬细小病毒对该疾病预防和治疗具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用。本研究以纯化的犬细小病毒单克隆抗体制备荧光抗体，对该荧光抗体的检测效果进行鉴定。并用该荧光抗体建立了 CPV 抗原的直接免疫荧光检测方法。
[0007]具体而言，本专利技术首先是分离纯化了一种犬细小病毒单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链CDR1
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3分别如SEQ DI NO.1
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3所示，所述单克隆抗体的重链CDR分别如SEQ DI NO.4
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6所示。
[0008]优选地，本专利技术还提供了一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，采用荧光基团标记所述犬细小病毒单克隆抗体，其中所述犬细小病毒单克隆抗体的轻链CDR1
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3分别如SEQ DI NO.1
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3所示，所述单克隆抗体的重链CDR分别如SEQ DI NO.4
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6所示。
[0009]优选地，本专利技术提供的所述荧光标记为FITC标记。
[0010]优选地，本专利技术提供的所述荧光抗体的最适工作浓度确定为 1:120。
[0011]进一步地，本专利技术还提供了一种非诊断目的的犬细小病毒抗原的直接免疫荧光检
测方法，该方法包括采用所述荧光标记的单克隆抗体接触待检样本，并在荧光显微镜下观察结果。
[0012]进一步地，本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
[0013]进一步地，本专利技术还提供了所述荧光标记的单克隆抗体在制备直接免疫荧光检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
[0014]进一步地，本专利技术还提供了一种犬细小病毒试剂盒，其特征在于，其包括上述的单克隆抗体。
[0015]进一步地，本专利技术还提供了一种直接免疫荧光检测犬细小病毒试剂盒，其包括上述任一项荧光标记的单克隆抗体。
[0016]本专利技术的优点如下：本专利技术提供的犬细小病毒单克隆抗体是针对 CPV 的特异性抗体，其与 CDV、RV、CAV 和 CCV 均不发生交叉反应。经鉴定，所述单克隆抗体的轻链CDR1
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3分别如SEQ ID NO.1
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3所示和重链CDR1
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3分别如SEQ ID NO.4
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6所示。本专利技术提供的基于犬细小病毒单克隆抗体的荧光抗体，本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象，所制备的荧光抗体具有特异性，该荧光抗体的最适工作浓度确定为 1:120。直接荧光检测法在荧光显微镜下可见病变细胞呈现明显黄绿色荧光，易于分辨；而正常细胞没有荧光出现。
附图说明
[0017]图1为单抗的间接免疫荧光图；图2为120倍稀释的单抗与CPV感染的F81细胞免疫荧光图；图3为120倍稀释的单抗与未感染的F81细胞免疫荧光图。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0019]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，并不用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0020]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0021]实施例1犬细胞病毒单克隆抗体1.1杂交瘤细胞系制备动物的免疫选取4只6周龄雌性BALB/c小鼠，用纯化的犬细小病毒对其进行免疫注射。首免用 200μL 的犬细小病毒与等量的弗氏完全佐剂混合做成乳化抗原后，对小鼠进行皮下免疫注射，400μL/只；于首免后第 14d 进行第二次免疫注射，换成弗氏不完全佐剂与等量病毒混合，充分乳化后，皮下免疫注射小鼠，剂量同首免；二免后第 14d 进行第三次免疫注射，方法与与剂量同二免。三免后第 10d 对小鼠断尾采血，用间接 ELISA 方法监测血清抗体效价。当抗体水平达到要求后，于三免第 14d 后，选择效价最高的免疫小鼠，用纯的
抗原液尾静脉加强免疫，3d 后无菌采取小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞融合。
[0022]在融合前一周复苏 SP2/0 骨髓瘤细胞并扩大培养。融合时将正处于对数分裂期 SP2/0 骨髓瘤细胞回收，1000r/min 离心 5min，用 1640 不完全培养液悬浮，重复洗 2 次，最后用 10mL 1640 不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
[0023]取加强免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中 5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有 10mL 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有 10mL 不完全培养基的平皿中，用 5mL 的注射器吸取培养液反复吹打脾，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基，制成脾细胞悬液。用移液器将悬液移入小试管中。直立小试管 3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。用 1640 不完本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链CDR1
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3分别如SEQ ID NO.1
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3所示，所述单克隆抗体的重链CDR分别如SEQ ID NO.4
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6所示。2.一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，采用荧光基团标记权利要求1所述的犬细小病毒单克隆抗体。3.如权利要求2所述的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述荧光标记为FITC标记。4.根据权利要求2
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3任一项所述的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述荧光抗体的最适工作浓度确定为 1:120。5.一种非诊断目的的犬细小病毒抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋新刚，任德强，孙博，张萌萌，李坚，张健，叶阳，郭伟，麻昌姣，依丽娟，胡燕玲，
申请(专利权)人：哈尔滨元亨生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：