一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到成活率高、抗体分泌能力强的细胞株A805，保藏编号为：CGMCC No.21902；步骤二、应用生物反应器制备抗猫瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞；步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，制得抗猫瘟热病毒单克隆抗体成品。该方法提高了瘟热病毒单克隆抗体的效价，克服了传统腹水生产抗体的缺点，使抗体产品无杂蛋白，理化性质稳定，批间差异小。

【技术实现步骤摘要】
一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法
本专利技术涉及一种猫瘟热病毒单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
猫瘟热（Felinedistemper）又叫猫泛白细胞减少症（Felinepanleukopenia）、猫传染性肠胃炎（Enteritisinfectiosafelum）或猫运动失调症（Felineataxiasyndrome）。1928年Verge和Cristoforoni证明该病是由病毒引起，1930年首先由Hammon和Ender报道分离到猫瘟热病毒，我国1984年首次从自然病例中分离到一株猫瘟热病毒。猫泛白细胞减少症病毒（Felinepanleukopeniavirus）是细小病毒科，细小病毒属成员。该病毒除感染家猫外，还能感染如虎、豹、貂以及浣熊等动物。幼猫多呈急性发病，表现为高热、呕吐、腹泻等症状，严重时死亡率高达90%。接种猫瘟热疫苗是预防猫瘟热最有效的途径之一。近年来，虽然疫苗的使用较为广泛，但世界各地仍有感染猫瘟热病毒的病例报道，对宠物以及养殖业均造成了较大经济损失。单克隆抗体是由单一细胞分泌的具有理化性质高度均一的抗体，其最大的特点是特异性强、纯度高、扩大生产简易，且经济成本较低。到目前为止，单克隆抗体的主要制备方法是小鼠腹水收集。将特定的杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔，让细胞在腹腔内增殖，7~10天后小鼠腹部增大，收集腹水。用此方法收集的抗体浓度较高，但是操作繁琐、产量低、无法规模化生产、小鼠易感染其他疾病，腹水中会有大量杂质蛋白等。目前应用生物反应器培养杂交瘤细胞，存在的问题主要集中在分泌的抗体浓度低，需要进行浓缩，使得经济成本大大提升。急需研究出应用生物反应器生产抗猫瘟热病毒单克隆抗体且无需进行浓缩的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法，该方法提高了瘟热病毒单克隆抗体的效价，克服了传统腹水生产抗体的缺点，使抗体产品无杂蛋白，理化性质稳定，批间差异小。通过使用成分明确的培养基，达到工艺简化、质量可控，产量提升的目标。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法，包括如下步骤：步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到成活率高、抗体分泌能力强的细胞株A805，其中：所述杂交瘤细胞选自能够稳定分泌抗猫瘟热病毒单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株，通过有限稀释法，挑选出1株成活率高、抗体分泌能力强的细胞株A805，其分类命名为杂交瘤细胞（hybridoma），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.21902，保藏日期为2021年2月25日；所述悬浮培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85；步骤二、应用生物反应器制备抗猫瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段（即：培养细胞增殖）和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞，将收获的细胞液进行离心分离，无需浓度制得抗猫瘟热病毒单克隆抗体成品；所述细胞生长阶段为以获得细胞数为主，抗体分泌阶段以持续稳定的获得大量分泌抗体为主；所述细胞生长阶段的培养条件：温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；所述抗体分泌阶段的培养条件：温度为34℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；所述生物反应器为搅拌式生物反应器；所述生物反应器培养细胞所用的培养基是无血清培养基，培养基分为两个部分：基础培养基和补料培养基；所述生物反应器内的培养方法为补料批次培养法；所述批次培养法为在生物反应器内放入罐体容积60%的培养基，细胞密度按1.0E6~1.2E6接种生物反应器，细胞在生物反应器内生长，一次性收获产品；所述补料批次培养法为在培养过程中补加补料培养基，其中：批次培养：种细胞接种量5*105个/ml在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进总培养体积3%的流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:640时（多在流加第6~7天达到），即可全部收获；所述生物反应器内的培养方式方法为单极培养法和/或逐级放大培养法；所述单极培养法为10L单极培养法，逐级放大培养法为10L-50L-200L逐级放大培养法；所述10L单级培养法以摇瓶培养细胞为种子细胞，将其接种到10L搅拌式生物反应器中进行培养，添加补料培养基，其中：种细胞接种量5*105个/ml在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进总培养体积3%的流加培养基，温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；所述10L-50L-200L逐级放大培养法以10L生物反应器培养细胞为种子细胞，再将种子细胞放大到50L生物反应器中培养，再以50L生物反应器中培养的细胞作为种子细胞，将其放大到200L生物反应器进行培养，产生抗体，其中：种细胞接种量5*105个/ml在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始添加流加培养基，每24小时流进总培养体积3%的流加培养基，温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧（DO）为40±10%，pH为6.8±0.2；步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，分装产品。为了清楚的表述本专利技术的保护范围，本专利技术对以下术语进行如下界定：本专利技术中的“交瘤细胞株”是将具有抗猫瘟热病毒单克隆抗体分泌的小鼠脾细胞和具有无限分裂的SP2/0细胞融合而成，所形成的杂交瘤细胞同时具有分泌抗体和无线增值的特性，包括但不限于本专利技术所举例的A805细胞。本专利技术中涉及的基础培养基和补料培养基为无血清培养基，其包括但不限于本专利技术。相比于现有技术，本专利技术具有如下优点：1、本专利技术应用有限稀释法进行抗猫瘟热病毒细胞克隆，筛选出一株生长状态好、成活率高的细胞株，该细胞株可以在无血清培养基内稳定生长。2、本专利技术采用单极培养法或逐级放大培养法，生产过程自动化控制，收获的细胞培养液不需要浓缩即可达到所需效价，降低生产成本，提高产品质量。3、本专利技术应用生物反应器使用无血清悬浮培养杂交瘤细胞以制备抗猫瘟热病毒单克隆，不需要进行膜浓缩以能达到所需的抗体效价，该方法应用的无血清培养基成分明确，不使用牛血清，从而避免血清中特异蛋白的残留，保证了产品质量。该培养基具有成分明确，生产过程和质量可控，稳定性好等优点。保藏信息：保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌猫瘟热病毒单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株A805，保藏编号为：CGMCCNo.21902。/n

【技术特征摘要】
1.一种分泌猫瘟热病毒单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株A805，保藏编号为：CGMCCNo.21902。


2.一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
步骤一、应用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，挑选单个细胞至无血清培养基中进行悬浮培养，得到成活率高、抗体分泌能力强的细胞株A805；
步骤二、应用生物反应器制备抗猫瘟热病毒单克隆，其中：所述生物反应器内分细胞生长阶段和抗体分泌阶段两个阶段培养杂交瘤细胞；
步骤三、收获细胞培养液为抗体，进行离心去除细胞碎片，制得抗猫瘟热病毒单克隆抗体成品。


3.根据权利要求2所述的利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤一中，悬浮培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70rpm，溶氧为40%，pH为6.85。


4.根据权利要求2所述的利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于所述步骤二中，细胞生长阶段的培养条件：温度为37℃，搅拌速度为50~90rpm，溶氧为40±10%，p...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙博，麻昌姣，叶阳，任德强，张健，张立恒，宋新刚，井鸿博，郭婷，
申请(专利权)人：哈尔滨元亨生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23