一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术分泌醚菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19680。将醚菌酯的完全抗原免疫BALB/c小鼠，将高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
醚菌酯(kresoxim-methyl)又称(E)-2-甲氧亚氨基-[2-(邻甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯，是一种高效、广谱、新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。对草莓白粉病、甜瓜白粉病、黄瓜白粉病、梨黑星病、葡萄白腐病等病害具有良好的防效。它能控制治疗子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲、卵菌纲等大多数病害。对孢子萌发及叶内菌丝体的生长有很强的抑制作用，具有保护、治疗和铲除活性。有很好的渗透性及局部内吸活性，持效期长，被广泛用于防治果树类、蔬菜类、茶树、烟草等作物上的病害。由于醚菌酯具有高效广谱的杀菌活性，可一次性或多次用于蔬菜、果树及禾谷类作物；若乱用、滥用或使用不当，药物可能通过食物链传递到人群，对人体的健康产生潜在风险。因此，《GB2763—2019食品中农药最大残留限量》中规定了醚菌酯在各种食品中的最大残留限量标准(MRL)，如其在糙米中的MRL为0.1mg/kg，在黄瓜中的MRL为0.5mg/kg，在苹果和梨中的MRL均为0.2mg/kg，在葡萄干中的MRL为2mg/kg，以及在草莓中的MRL为1mg/kg。为了有效监督监测醚菌酯的使用情况，防止药物的不规范使用，有必要开发一种高灵敏度、高特异性的检测方法，而目前检测方法如高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等仪器检测方法，其样品前处理过程极为复杂、成本昂贵，并且仪器方法并不适用于现场检测。免疫学检测方法是一种低成本、快速且高灵敏度高特异性的检测方法，而且操作简便、成本低，已广泛适用于药物残留检测领域。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一株醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对醚菌酯具有较高的检测灵敏度，可以用来建立醚菌酯的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCCNo.19680。醚菌酯单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.19680的杂交瘤细胞株AE分泌产生。醚菌酯半抗原，结构简式如下：醚菌酯半抗原的制备方法：称取2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于甲醇、水和吡啶的混合溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，水浴持续搅拌反应后，取出，室温条件下避光过夜；随后，氮吹，加入三氯甲烷溶解，再加入纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。进一步地，步骤如下：称取100mg的2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于10mL甲醇、水和吡啶的混合溶液；所述混合溶液中甲醇：水：吡啶体积比依次为4：1：1；加入226mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于70℃水浴持续搅拌反应6h后，取出，室温条件下避光过夜；随后，氮吹，加入5mL三氯甲烷溶解，再加入5mL纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。醚菌酯完全抗原的制备方法：称取醚菌酯半抗原，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应，得到醚菌酯半抗原活化液；将钥孔血蓝蛋白KLH用硼酸缓冲溶液溶解，称为蛋白A液；在室温条件，将醚菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯完全抗原。进一步地，步骤为：称取4.0mg醚菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入7.0mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐，3.9mgN-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应8h，得到醚菌酯半抗原活化液；将钥孔血蓝蛋白10mg，用3mL硼酸缓冲溶液溶解，称为蛋白A液；在室温条件，将醚菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯完全抗原。醚菌酯包被原的制备方法，称取醚菌酯半抗原，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应，得到醚菌酯半抗原活化液；称取鸡卵白蛋白OVA，溶解于硼酸缓冲溶液中，称为B液；在室温条件下，将醚菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯包被原。进一步地，步骤为：称取4.8mg醚菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入7.7mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.6mgN-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h，得到醚菌酯半抗原活化液；称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中，称为B液，在室温条件下，将醚菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得醚菌酯包被原。分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE的制备方法：取高效价低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和亚克隆，得到一株醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE；步骤为：(1)小鼠的免疫：醚菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后，通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂。每一次加强免疫之间均间隔3周。最后一次加强免疫采用完全抗原(不含佐剂)进行腹腔注射；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制率；(2)细胞融合与细胞株建立：通过PEG法将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基选择性培养，ic-ELISA检测细胞孔的阳性和抑制率，通过有限稀释法对阳性及抑制率较高的杂交瘤细胞进行亚克隆，最终筛选获得醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE；(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度。所述醚菌酯单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中醚菌酯残留的分析检测。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株AE分泌的单克隆抗体，对醚菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.5ng/mL)，可实现对果蔬、谷物中醚菌酯残留量的检测，为食品中醚菌酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCCNo.19680。附图说明图1醚菌酯单克隆抗体的标准抑制曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将醚菌酯完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19680。/n

【技术特征摘要】
1.一株分泌醚菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株AE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCCNo.19680。


2.醚菌酯单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.19680的杂交瘤细胞株AE分泌产生。


3.醚菌酯半抗原，其特征在于结构简式如下：





4.醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于：称取2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于甲醇、水和吡啶的混合溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，水浴持续搅拌反应后，取出，室温条件下避光过夜；随后，氮吹，加入三氯甲烷溶解，再加入纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。


5.根据权利要求4所述醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：称取100mg的2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于10mL甲醇、水和吡啶的混合溶液；所述混合溶液中甲醇：水：吡啶体积比依次为4：1：1；加入226mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于70℃水浴持续搅拌反应6h后，取出，室温条件下避光过夜；随后，氮吹，加入5mL三氯甲烷溶解，再加入5mL纯水萃取三次，除去上层水相后，下层有机相经氮气吹干后，得到醚菌酯半抗原。


6.醚菌酯完全抗原的制备方法，其特征在于：称取醚菌酯半抗原，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应，得到醚菌酯半抗原活化液；将钥孔血蓝蛋白用硼酸缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，林璐，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32