本发明专利技术公开了犬I型腺病毒单克隆抗体/多克隆抗体、双抗夹心ELISA试剂盒和应用。本发明专利技术用CAdV‑1作为免疫原分别免疫小鼠和家兔，最终获得了1株特异性单抗并制备得到特异性兔源多抗；进一步采用单克隆抗体和酶标多抗以及筛选的最佳反应条件建立了双抗夹心ELISA检测方法。采用本发明专利技术所建立的双抗夹心ELISA检测方法具有较好的批内和批间重复性，敏感性和特异性。与RT‑PCR方法比较，本发明专利技术双抗夹心ELISA方法的敏感性为93.75％，特异性为90.9％，符合率为92.86％，表明本发明专利技术所建立的CAdV‑1抗原双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，能用于CAdV‑1的临床检测。
【技术实现步骤摘要】
犬I型腺病毒单克隆抗体/多克隆抗体、双抗夹心ELISA试剂盒和应用
本专利技术涉及犬腺病毒抗体，尤其涉及犬I型腺病毒单克隆抗体/多克隆抗体以及由此构建的犬I型腺病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒，属于犬I型腺病毒的ELISA领域。
技术介绍
犬腺病毒(Canineadenovirus，CAdV)是双链DNA病毒，包括Ⅰ型和Ⅱ型。犬Ⅰ型腺病毒(Canineadenovirustype1，CAdV-1)主要引起急性败血性肝炎(犬)和脑炎(熊和狐)。CAdV-1广泛分布于世界各地，其致病性强、感染谱广，除了犬和狐狸外，CAdV-1还能对野生肉食哺乳动物(狼、棕熊、黑熊和水獭等)造成致死性感染。CAdV可跨物种传染，不仅可感染宠物犬，还能够感染狼、郊狼、臭鼬、狐狸、熊和狮子等野生动物。CAdV-1感染对家犬和野生动物具有潜在的威胁。因此，建立高效、快速的检测方法是预防和及时发现疫情的关键措施。夏咸柱等于1983年在中国首次从患有传染性肝炎的犬中分离得到CAdV-1，并于1990年建立了CAdV-1的系统性实验室诊断方法，证实CAdV-1在中国养犬业中普遍存在(夏咸柱等，1984；夏咸柱等，1990)。钟志宏等于1989年分离得到中国第一株狐源CAdV-1，范泉水等于1999在患支气管炎的犬中分离得到CAdV-2(范泉水等，1999；钟志宏等，1990)。随后的几年，在灰熊、大熊猫、老虎等野生哺乳动物中也检测到CAdV-1。CAdV-1感染性强，致死率高，是影响中国经济动物养殖业发展的重要疫病之一(范泉水等，2005；李秦等，2000；刘大飞等，2010)。近年来，国内虽然没有出现有关CAdV-1大规模爆发的情况，但国外多数国家持续的高感染率和高爆发率情况屡见不鲜，仍然要进一步加强对CAdV-1的预防与监测力度。血清中和试验(SN)是检测病毒血清中和抗体的传统方法之一，SN具有敏感性强、特异性和稳定性好等方面的优点，一直为国内外学者所认同(Loeffen，2012；Whetstone，1988)。SN一直作为CAdV血清抗体检测的金标准用于评估CAdV疫苗免疫效果和监测免疫动物血清中和抗体效价。姜莉莉等建立了针对CAdV-1的微量血清中和试验，进一步优化了传统SN的检测效果(姜莉莉等，2011)。由于SN方法检测周期较长且操作复杂，在大规模的流行病学调查中已逐渐被其他方法代替。ELISA技术是利用有机材料(如聚苯乙烯)能有效吸附蛋白质等物质的特性，将有机材料制成的微孔板作为固相载体，将蛋白(抗原或抗体)包被在其中，依次将各反应物质加入到其中，每次必须洗脱掉未结合的成分，最后通过显色液与过氧化物酶的相互作用进行显色和结果判定(Engvalletal.，1971)。ELISA检测方法在CAdV-1的血清学调查和临床诊断中扮演重要角色。张汇东和马志勇等建立了早期的斑点ELISA检测方法用于CIHV的检测(马志勇等，1992；张汇东等，1991)；郑海发和姜莉莉等建立了针对狐狸脑炎的间接ELISA检测方法(姜莉莉等，2008；郑海发等，1992)；葛艳华等利用纯化后的CAdV-2全病毒为包被抗原建立了针对CAdV-2的间接ELISA检测法，该方法对CAdV-2具有高敏感性和特异性，但针对CAdV-1的检测效果尚未报道(葛艳华等，2010)；Walker等在前人基础上利用纯化后的CAdV-1和CAdV-2细胞毒同时作为包被抗原，建立针对CAdV的间接ELISA检测方法(Walkeretal.，2016)。以全病毒作为包被抗原的传统ELISA方法，其病毒粒子大多是通过超速离心方式得到，病毒的浓度及纯度均较低，在一定程度上影响了ELISA检测方法的敏感性和特异性。自1915年建立杂交瘤技术以来，针对病毒结构蛋白、细菌以及细胞因子等的单克隆抗体(mAb)不断出现。2015年，各国抗体药物成交总额超过了850亿美元。杂交瘤技术可结合B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的优点，产生杂交瘤细胞具有双亲功能，既能合成抗体细胞又能分泌特定抗体，还可以在体外无限增殖。利用该技术仅使用少量抗原就能够产生大量抗体，且浓度很高。在传染病的防治和检测方面效果显著，具有其他方法不可比拟的优势。此外，单克隆抗体并不要求过高的抗原纯度，低纯度的抗原就可以产生高特异性的抗体。由于双抗夹心ELISA方法使用了两种抗体，因此，检测的准确性更高。但是建立检测犬I型腺病毒的双抗夹心ELISA方法的前提是需要制备得到特异性强的犬I型腺病毒单克隆抗体及多克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供特异性的犬I型腺病毒单克隆抗体以及多克隆抗体；本专利技术的目的之二是提供检测犬I型腺病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术首先提供了一株分泌犬I型腺病毒抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为CAdV-1-F1301-01A，其微生物保藏编号为CGMCCNO.19661；保藏时间：2020年4月8日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本专利技术进一步提供了特异性的犬I型腺病毒单克隆抗体，该犬I型腺病毒单克隆抗体由微生物保藏编号为CGMCCNO.19661的杂交瘤细胞株所分泌。本专利技术进一步提供了犬I型腺病毒多克隆抗体，其制备方法包括：以犬I型腺病毒免疫原免疫兔子制备得到犬I型腺病毒多克隆抗体；更优选的，其制备方法包括：用弗氏完全佐剂充分乳化犬I型腺病毒免疫原后首免健康洁净级大白兔，2免、3免均用弗氏不完全佐剂与免疫原充分乳化，免疫剂量均为500μg/只，背部皮下多点注射，免疫间隔为14d。3免结束10天后对实验兔耳缘静脉采血并测定血清效价，得到特异性的犬I型腺病毒多克隆抗体。本专利技术所提供的犬I型腺病毒单克隆抗体以及犬I型腺病毒多克隆抗体能够应用于检测犬I型腺病毒，譬如，应用犬I型腺病毒单克隆抗体采用Westernblot、免疫荧光或ELISA检测方法等检测样品中的犬I型腺病毒；或者是利用HRP标记犬I型腺病毒多克隆抗体，制备酶标抗体，采用获得的犬I型腺病毒单克隆抗体联合酶标多克隆抗体建立犬I型腺病毒双抗夹心ELISA检测方法。将犬I型腺病毒单克隆抗体包被在酶标板是双抗体夹心ELISA中至关重要的一步。当抗体包被浓度过低时，不能完全覆盖固体载体表面，从而导致捕获抗体吸附的抗原量不足，有可能会出现假阴性；使用过高的抗体包被浓度时，容易导致抗体分子之间的相互作用。在洗涤时，这些抗体很容易被洗掉，影响实验的灵敏度。如果浓度过高，会增强非特异性反应，导致阳性结果过高，影响测量的灵敏度。因此，筛选抗体的包被浓度对于建立的ELISA检测方法非常重要。本专利技术进一步提供了一种CAdV-1抗原检测ELISA试剂盒，包括：一抗，酶标记的二抗，抗体稀释液、洗涤液、封闭液，显色液；其中，所述的一抗是微生物保藏编号为CGMCCNO.19661的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该抗体作为包被抗体；所述的二抗是犬I型腺病毒多克隆抗体，其通过用CAdV-1抗原作为免疫原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株分泌犬I型腺病毒抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC NO.19661。/n
【技术特征摘要】
1.一株分泌犬I型腺病毒抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCCNO.19661。
2.由权利要求1的杂交瘤细胞株所分泌的犬I型腺病毒单克隆抗体。
3.犬I型腺病毒多克隆抗体，其特征在于，其制备方法包括：以犬I型腺病毒免疫原免疫兔子，收集兔血清制备得到特异性的犬I型腺病毒多克隆抗体。
4.按照权利要求3所述的犬I型腺病毒多克隆抗体，其特征在于，其制备方法包括：用弗氏完全佐剂充分乳化犬I型腺病毒免疫原后首免健康洁净级大白兔，2免、3免均用弗氏不完全佐剂与免疫原充分乳化，免疫剂量均为500μg/只，背部皮下多点注射，免疫间隔为14d；3免结束10天后对实验兔耳缘静脉采血并测定血清效价得到犬I型腺病毒多克隆抗体。
5.权利要求2所述的犬I型腺病毒单克隆抗体在制备诊断或检测犬I型腺病毒试剂中的用途。
6.权利要求3或4...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱言柱，廉士珍，孙杰，张蕾，邓效禹，胡博，闫喜军，徐金凤，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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