一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明专利技术中的杂交瘤细胞株MY‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20796，其所分泌的分泌雷公藤甲素单克隆抗体对雷公藤甲素具有高灵敏度（IC50值为0.673 ng/mL）和高特异性。同时，其检测效果不受基质干扰，可用于蜂蜜、药材等其它样本中雷公藤甲素的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及免疫检测
，具体涉及一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
雷公藤系卫矛科植物，属于传统的中药，有大毒。雷公藤是我国特有的有毒植物，主要有3个物种：雷公藤、昆明山海棠和东北雷公藤，三者主要分布在我国南方山区、西南山区和东北长白山区。作为传统中药材，雷公藤有着悠久的使用历史，具有祛风除湿、活血通络和消肿止痛等功效，在中医临床上主要用来治疗类风湿关节炎、红斑狼疮、小儿紫癜等自身免疫性疾病。由于雷公藤本身具有较强的毒性，使用安全剂量范围较窄，治疗剂量与中毒剂量较为接近等弊端，在临床使用过程中时常发生中毒事件，严重者甚至致人死亡。此外，在雷公藤的花期，蜜蜂会采集其花蜜酿制有毒蜂蜜，人一旦食用，也会发生蜂蜜中毒现象，甚至引发群体性中毒事件。近年来，雷公藤中药材种植基地和部分山区集中连片分布的雷公藤也为蜜蜂酿制有毒蜂蜜提供了有利条件。雷公藤植物中具有药理活性的物质十分丰富，目前已经鉴定出来的化学物质高达200余种，依据其化学结构主要分为二萜类、三萜类和生物碱等，而雷公藤甲素、雷公藤红素和雷公藤生物碱分别是三者主要代表性化合物。二萜类生物碱因具有强烈药理活性和毒性，是雷公藤植物中发挥药效，以及引起中毒反应的关键物质。如何有效地定量检测药材、蜂蜜等样本中雷公藤甲素的含量，对于保证药材质量，规避中毒等具有重要现实意义。当前对蜂蜜中雷公藤甲素含量的检测主要依赖于高效液相色谱、液相色谱串联质谱等仪器分析方法，这些技术手段通常需要专业实验的专业人员进行检测，不仅耗时费力，而且具有花费较大、通量低等弊端，难以满足众多样本中雷公藤甲素含量的快速检测。因此，建立一种快速简便的雷公藤甲素检测方法具有重要意义。基于抗原抗体特异性结合反应开发的免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、且具有简单、快速等优点，目前，基于免疫分析方法开发的酶联免疫法(ELISA)和胶体金试纸条等产品已经广泛应用于食品安全、临床诊断等的现场快速检测。然而，构建免疫分析方法的核心是优质抗体，一旦有了优质抗体，可以有多种免疫分析模式构建分析方法。因此，获得针对雷公藤甲素的高特异性和高灵敏度的单克隆抗体尤为关键。目前，市场上尚无可供使用的雷公藤甲素单克隆抗体细胞株及其抗体，相关的文献中虽然提到了有关雷公藤甲素的单克隆抗体细胞株，但其灵敏度和特异性较差。目前，已报道的最佳雷公藤甲素单克隆抗体的IC50为280µg/L，然而实际样本，如有毒蜂蜜中雷公藤甲素残留的量很低，通常低于10µg/L左右。当前，已报道的雷公藤甲素单克隆抗体难以满足当前实际应用中高灵敏度的需求，如有毒蜂蜜的快速鉴别、雷公工中毒的快速诊断、中药材的真伪鉴别等。因此，亟需开发和制备出一种高灵敏度、高特异性的雷公藤甲素的单克隆抗体。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。具体而言，本专利技术经过长期的试验，筛选到了一株具有高灵敏度和高特异性的分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MY-1，并将其提交相关的机构进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.20796；分类命名为：BalB/c小鼠杂交瘤细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；保藏时间是2020年10月12日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编为100101。第二方面，本专利技术提供一种雷公藤甲素单克隆抗体，其由所述的杂交瘤细胞株MY-1分泌获得。作为优选，所述雷公藤甲素单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4-6所示。作为优选，所述雷公藤甲素单克隆抗体的重、轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。本专利技术进一步提供一种用于检测雷公藤甲素的试剂、试纸条或试剂盒，其含有所述的雷公藤甲素单克隆抗体。在一些实施方案中，所述的试纸条可以为免疫层析试纸条或胶体金免疫检测试纸条。在一些实施方案中，所述的试剂盒可以为酶联免疫分析检测试剂盒。第三方面，本专利技术提供所述的雷公藤甲素单克隆抗体或所述的试剂、试纸条或试剂盒在检测雷公藤甲素方面的应用。本专利技术进一步提供一种检测雷公藤甲素的方法，使用所述的雷公藤甲素单克隆抗体，或者使用所述的试剂、试纸条或试剂盒。本专利技术中的雷公藤甲素单克隆抗体的检测效果不受基质干扰，因此也可以用于对可能含有雷公藤甲素的食物（如蜂蜜等）或者药材的检测。基于此特点，本专利技术进一步提供所述的雷公藤甲素单克隆抗体或所述的试剂、试纸条或试剂盒在检测蜂蜜安全性中的应用。若蜂蜜中不含有雷公藤甲素或其含量低于相关标准，则判断其安全，若蜂蜜中雷公藤甲素的含量高于相关标准，则判断其为有毒蜂蜜。本专利技术还提供所述的雷公藤甲素单克隆抗体或所述的试剂、试纸条或试剂盒在检测雷公藤甲素中药材质量中的应用。若中药中的雷公藤甲素含量在质控含量范围内，则判断其质量合格，若中药中不含有雷公藤甲素或雷公藤甲素含量超标，则判断其质量不合格。基于上述技术方案，本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术中的杂交瘤细胞株MY-1所分泌的分泌雷公藤甲素单克隆抗体对雷公藤甲素具有高灵敏度（IC50值为0.673ng/mL）和高特异性。同时，其检测效果不受基质干扰，可用于蜂蜜、药材等其它样本中雷公藤甲素的快速检测。附图说明图1为雷公藤甲素半抗原的化学结构。图2为本专利技术雷公藤甲素单克隆抗体对雷公藤甲素的抑制标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。实施例1：完全抗原的合成及动物免疫1、雷公藤甲素半抗原TRI-HS的制备：用5.0mL无水吡啶分别溶解雷公藤甲素(20mg)与琥珀酸酐(8mg)，将两种反应液混合，置于油浴磁力搅拌器避光反应8h(60℃，240rpm)，得到反应产物。反应体系加水淬灭后，用乙酸乙酯萃取，后用稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩后，经制备色谱的C18色谱分离纯化后即可获得目标化合物雷公藤甲素半抗原(TRI-HS，11.3mg，产率44.7%)。由于雷公藤甲素的化学结构中仅仅含有一个羟基可供链接，因此，琥珀酸只能可能发生在该羟基上，图1详细展示了雷公藤甲素半抗原的化学结构。获得半抗原经液相串联高分辨质谱分析，结果显示半抗原的精确质量数为m/z461.18061，与雷公藤甲素的精确质量数m/z361.16456相比，分子量增加了100Da，表示半抗原合成成功。2、雷公藤甲素完全抗原TRI-HS-BSA的制备：（1）分别称取3mg实施例1制得的TRI-HS、1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MY-1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20796。/n

【技术特征摘要】
1.一种分泌雷公藤甲素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MY-1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20796。


2.雷公藤甲素单克隆抗体，其由权利要求1所述的杂交瘤细胞株MY-1分泌获得。


3.根据权利要求2所述的雷公藤甲素单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4-6所示。


4.根据权利要求3所述的雷公藤甲素单克隆抗体，其特征在于，其重、轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。


5.一种用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，周金慧，李熠，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11