IRG1单克隆抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种IRG1单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明专利技术采用保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.21098的杂交瘤细胞制备IRG1单克隆抗体，可用于检测样品中的IRG1。

【技术实现步骤摘要】
IRG1单克隆抗体及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物
，特别是涉及IRG1单克隆抗体及其制备方法和用途。
技术介绍
IRG1蛋白在天然免疫过程中发挥重要作用,研究表明，多种病原微生物感染均会上调IRG1蛋白的表达(DifferentialinnateimmuneresponseprogramsinneuronalsubtypesdeterminesusceptibilitytoinfectioninthebrainbypositivestrandedRNAviruses.NatMed.2013Apr，19(4):458-64)。但是目前市场上没有抗IRG1的单克隆抗体。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种IRG1单克隆抗体及其制备方法和用途，填补现有技术的空白。本专利技术一方面提供了杂交瘤细胞株HOO56-IRG1,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.21098。本专利技术另一方面提供通过上述杂交瘤细胞株HOO56-IRG1分泌产生的IRG1单克隆抗体。进一步地，所述IRG1单克隆抗体为IgG。本专利技术另一方面提供IRG1单克隆抗体在用于制备检测样品中IRG1的制剂中用途。进一步地，所述检测是为免疫印迹法或者免疫组化分析法。本专利技术另一方面提供了一种检测样品中IRG1的试剂盒，所述试剂盒中含有上述IRG1单克隆抗体。本专利技术另一方面提供了上述IRG1单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)提供免疫原：采用氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽作为免疫原并与载体蛋白交联获得交联免疫原；2)制备杂交瘤细胞：用交联的免疫原免疫动物，取免疫动物的脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞并培养；3)制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞，打入小鼠腹腔内，从腹水中提取单克隆抗体。进一步地，载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。进一步地，所述交联免疫原与免疫佐剂混合乳化后，在小鼠背部通过多点皮下注射，并经二次以上加强免疫，血清的效价大于1∶10000。进一步地，所述提取单克隆抗体的方法为现有技术，本领域技术人员可以通过现有知识知晓如何提取。进一步地，所述方法包括步骤4)对单克隆抗体进行纯化。进一步地，所述纯化包括蛋白A亲和纯化以及肽亲和纯化。如上所述，本专利技术的IRG1单克隆抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本专利技术提供的IRG1单克隆抗体能够有效的识别IRG1。细胞名称：杂交瘤细胞株保藏时间：2020年12月04日保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号：CGMCCNo.21098保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号附图说明图1为Westernblot图，泳道B检测的约53kDa的条带即为IRG1蛋白信号。具体实施方式多肽，其序列为：KGPSPPEVASNSPAC(SEQIDNO.1)。用此多肽制备的抗IRG1单克隆抗体可以在免疫印迹(Westernblot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然IRG1蛋白。抗IRG1抗体是通过以下步骤获得的：步骤一：多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对IRG1蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定ADORA2A-AS1蛋白18个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，氨基酸序列为KGPSPPEVASNSPAC(SEQIDNO.1)。步骤二：多肽合成和交联：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；为增强多肽的抗原性，将IRG1多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。步骤三：多肽免疫和杂交瘤的制备：将交联后的IRG1-KLH与弗氏佐剂混合乳化，在BalB/C小鼠背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时加强免疫。步骤四：：杂交瘤制备：加强免疫三天后处死小鼠，取脾脏研磨，与小鼠骨髓瘤细胞按10：1比例混合，PEG融合。依次用HAT与HT培养基进行培养，有限稀释法得到单克隆，用间接ELISA放检测上清OD值，挑选高OD值的单克隆细胞株细胞株，扩大培养。步骤五：制备腹水：BalB/C小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，7天后向腹腔注射制备好的杂交瘤。7-10天待小鼠腹部隆起，抽取小鼠腹水。步骤六：抗体纯化：分离小鼠腹水，采用ProteinA纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。抗IRG1单克隆抗体是通过以下步骤鉴定的：将所获得的IRG1抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法用于检测抗原，确认该抗体能够与变性后的天然IRG1蛋白相互作用。以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。实施例1)多肽序列的分析和设计利用DNAstar软件对IRG1蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定IRG1蛋白上的18个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为KGPSPPEVASNSPAC。(SEQIDNO.1)2)多肽合成和交联合成：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙睛，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。交联：采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mgKLH溶于0.5ml超纯水中；取3mgsulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3MNaOH调pH值7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株HOO56-IRG1,其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.21098。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株HOO56-IRG1,其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.21098。


2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株HOO56-IRG1分泌产生的IRG1单克隆抗体。


3.如权利要求2所述的IRG1单克隆抗体在制备用于检测样品中IRG1的制剂中用途。


4.一种检测样品中IRG1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求2所述的IRG1单克隆抗体。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测是为免疫印迹法或者免疫组化分析法。


6.如权利要求2所述的IRG1单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1）提供免疫原：采用氨基酸序列如SEQIDNO.1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树珑，
申请(专利权)人：江苏亲科生物研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32