Claudin18.2单克隆抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种Claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明专利技术采用保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45150的杂交瘤细胞制备Claudin 18.2单克隆抗体，可用于检测样品中的Claudin 18.2。18.2。18.2。

【技术实现步骤摘要】
Claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及Claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]Claudin 18.2蛋白是位于细胞膜上的一个跨膜蛋白，在多种肿瘤尤其是消化系统肿瘤及其转移瘤中发现高表达。近年来，其特异性抗体claudiximab(zolbetuximab/IMAB362)在最新的临床试验中取得了显著的成功，claudin 18.2蛋白有望成为某些特定恶性肿瘤靶向治疗的分子靶点。但是目前市场上没有Western blot用途的可以用于小鼠和大鼠样本的Claudin 18.2的鼠源单克隆抗体。

技术实现思路

[0003]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种Claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途，填补现有技术的空白。
[0004]本专利技术一方面提供了杂交瘤细胞株HOO57
‑
Claudin 18.2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45150。
[0005]本专利技术另一方面提供通过上述杂交瘤细胞株HOO57
‑
Claudin 18.2分泌产生的Claudin18.2单克隆抗体。
[0006]进一步地，所述Claudin 18.2单克隆抗体为IgG1。
[0007]本专利技术另一方面提供Claudin 18.2单克隆抗体在用于制备检测样品中Claudin 18.2的制剂中用途。
[0008]进一步地，所述检测是为免疫印迹法或者免疫组化分析法。
[0009]本专利技术另一方面提供了一种检测样品中Claudin 18.2的试剂盒，所述试剂盒中含有上述Claudin 18.2单克隆抗体。
[0010]本专利技术另一方面提供了上述Claudin 18.2单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]1)提供免疫原：采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽作为免疫原并与载体蛋白交联获得交联免疫原；
[0012]2)制备杂交瘤细胞：用交联的免疫原免疫动物，取免疫动物的脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞并培养；
[0013]3)制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞，打入小鼠腹腔内，从腹水中提取单克隆抗体。
[0014]进一步地，所述SEQ ID NO.1所示的多肽经过进一步修饰获得述SEQ ID NO.2所示的多肽，将SEQ ID NO.2所示的多肽与载体蛋白交联。
[0015]进一步地，载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。
[0016]进一步地，所述交联免疫原N端通过交联剂将其巯基与载体蛋白氨基共价交联。
[0017]进一步地，所述交联免疫原与免疫佐剂混合乳化后，在小鼠背部通过多点皮下注
射，并经二次以上加强免疫，血清的效价大于1∶20000。
[0018]进一步地，所述提取单克隆抗体的方法为现有技术，本领域技术人员可以通过现有知识知晓如何提取。
[0019]进一步地，所述方法包括步骤4)对单克隆抗体进行纯化。
[0020]进一步地，所述纯化包括蛋白G亲和纯化以及肽亲和纯化。
[0021]如上所述，本专利技术的Claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
[0022]本专利技术提供的Claudin 18.2单克隆抗体能够有效的识别Claudin 18.2。
[0023]细胞名称：杂交瘤细胞
[0024]保藏时间：2022年04月29日
[0025]保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0026]保藏编号：CGMCC No.45150
[0027]保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
附图说明
[0028]图1为Western blot图，泳道B检测的约17kDa的条带即为Claudin 18.2蛋白信号。
具体实施方式
[0029]多肽，其序列为：TQDLYNNPVT(SEQ ID NO.1)。用此多肽制备的抗Claudin 18.2单克隆抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然Claudin 18.2蛋白。抗Claudin 18.2抗体是通过以下步骤获得的：
[0030]步骤一：多肽序列的分析和设计：利用Abdesigner软件对Claudin 18.2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定Claudin 18.2蛋白32
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42位10个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为TQDLYNNPVT(SEQ ID NO.1)。
[0031]步骤二：多肽合成和交联：利用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；
[0032]为增强多肽的抗原性，将Claudin 18.2多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo
‑
SMCC交联法进行交联。
[0033]步骤三：多肽免疫和杂交瘤的制备：将交联后的Claudin 18.2
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KLH与弗氏佐剂混合乳化，在BalB/C小鼠背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时加强免疫。
[0034]步骤四：：杂交瘤制备：加强免疫三天后处死小鼠，取脾脏研磨，与小鼠骨髓瘤细胞按10：1比例混合，PEG融合。依次用HAT与HT培养基进行培养，有限稀释法得到单克隆，用间接ELISA放检测上清OD值，挑选高OD值的单克隆细胞株细胞株，扩大培养。
[0035]步骤五：制备腹水：BalB/C小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，7天后向腹腔注射制备好的杂交瘤。7天待小鼠腹部隆起，抽取小鼠腹水。
[0036]步骤六：抗体纯化：分离小鼠腹水，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。
[0037]抗Claudin 18.2单克隆抗体是通过以下步骤鉴定的：将所获得的Claudin 18.2抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法用于检测抗原，确认该抗体能够与变性后的天然Claudin18.2蛋白相互作用。
[0038]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株HOO57
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Claudin 18.2,其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45150。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株HOO57
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Claudin 18.2分泌产生的Claudin 18.2单克隆抗体。3.如权利要求2所述的Claudin 18.2单克隆抗体在制备用于检测样品中Claudin 18.2的制剂中用途。4.一种检测样品中Claudin 18.2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求2所述的Claudin 18.2单克隆抗体。5.如权利要求4所述的Claudin 18.2单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)提供免疫原：采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽作为免疫原并与载体蛋白交联获得交联免疫原；2)制备杂交...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树珑，陆文婷，王辉，司国栋，
申请(专利权)人：江苏亲科生物研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：