SIGLEC15单克隆抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种SIGLEC15单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明专利技术采用保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45151的杂交瘤细胞制备SIGLEC15单克隆抗体，可用于检测样品中的SIGLEC15。可用于检测样品中的SIGLEC15。可用于检测样品中的SIGLEC15。

Siglec15 monoclonal antibody and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
SIGLEC15单克隆抗体及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及SIGLEC15单克隆抗体及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]2019年3月5日，自然医学杂志刊登了陈列平教授团队发现的新的免疫抑制分子SIGLEC15。SIGLEC15广泛的表达于多种肿瘤细胞。该分子不是简单的PD
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1/PD
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L1翻版，研究发现，PD
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L1和SIGLEC15的表达是互斥的，这就预示着SIGLEC15的抗体有可能在anti
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PD
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1/PD
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L1治疗无响应的患者身上是有效的。SIGLEC15很有可能是一个补充治疗靶点，可以为那些anti
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PD
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1/PD
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L1治疗无响应的患者提供新的治疗选择。这一重大发现产生轰动影响。更重要的是，在多种小鼠肿瘤模型上，SIGLEC15单克隆抗体(α
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S15)治疗取得了令人振奋的疗效。首个针对实体瘤的SIGLEC15人源化单克隆抗体(NC318)已进入临床I期研究。此外，因为SIGLEC15通路是肿瘤免疫逃逸的途径之一，以其为靶点的治疗也是陈教授提出的肿瘤免疫治疗正常化思想内容的一部分。
[0003]但是目前市场上没有免疫组织化学用途的SIGLEC15的鼠源单克隆抗体。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种SIGLEC15单克隆抗体及其制备方法和用途，填补现有技术的空白。
[0005]本专利技术一方面提供了杂交瘤细胞株HOO57
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SIGLEC15,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45151。
[0006]本专利技术另一方面提供通过上述杂交瘤细胞株HOO56
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IRG1分泌产生的SIGLEC15单克隆抗体。
[0007]进一步地，所述SIGLEC15单克隆抗体为IgG1。
[0008]本专利技术另一方面提供SIGLEC15单克隆抗体在用于制备检测样品中SIGLEC15的制剂中用途。
[0009]进一步地，所述检测是为免疫印迹法或者免疫组化分析法。
[0010]本专利技术另一方面提供了一种检测样品中SIGLEC15的试剂盒，所述试剂盒中含有上述SIGLEC15单克隆抗体。
[0011]本专利技术另一方面提供了上述SIGLEC15单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]1)提供免疫原：采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽作为免疫原并与载体蛋白交联获得交联免疫原；
[0013]2)制备杂交瘤细胞：用交联的免疫原免疫动物，取免疫动物的脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞并培养；
[0014]3)制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞，打入小鼠腹腔内，从腹水中提取单克隆抗体。
[0015]进一步地，所述SEQ ID NO.1所示的多肽经过进一步修饰获得述SEQ ID NO.2所示的多肽，将SEQ ID NO.2所示的多肽与载体蛋白交联。
[0016]进一步地，载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。
[0017]进一步地，所述交联免疫原N端通过交联剂将其巯基与载体蛋白氨基共价交联。
[0018]进一步地，所述交联免疫原与免疫佐剂混合乳化后，在小鼠背部通过多点皮下注射，并经二次以上加强免疫，血清的效价大于1∶30000。
[0019]进一步地，所述提取单克隆抗体的方法为现有技术，本领域技术人员可以通过现有知识知晓如何提取。
[0020]进一步地，所述方法包括步骤4)对单克隆抗体进行纯化。
[0021]进一步地，所述纯化包括蛋白G亲和纯化以及肽亲和纯化。
[0022]如上所述，本专利技术的SIGLEC15单克隆抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
[0023]本专利技术提供的SIGLEC15单克隆抗体能够有效的识别SIGLEC15。
[0024]细胞名称：杂交瘤细胞
[0025]保藏时间：2022年04月29日
[0026]保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027]保藏编号：CGMCC No.45151
[0028]保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
附图说明
[0029]图1为免疫组织化学方法测试SIGLEC15蛋白在肝癌组织的表达情况
具体实施方式
[0030]多肽，其序列为：AHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPAPGNSSA(SEQ ID NO.1)。用此多肽制备的抗SIGLEC15单克隆抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然SIGLEC15蛋白。抗SIGLEC15抗体是通过以下步骤获得的：
[0031]步骤一：多肽序列的分析和设计：利用Abdesigner软件对SIGLEC15蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定SIGLEC15蛋白180
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220位30个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为AHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPAPGNSSA(SEQ ID NO.1)。
[0032]步骤二：多肽合成和交联：利用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；
[0033]为增强多肽的抗原性，将SIGLEC15多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo
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SMCC交联法进行交联。
[0034]步骤三：多肽免疫和杂交瘤的制备：将交联后的SIGLEC15
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KLH与弗氏佐剂混合乳化，在BalB/C小鼠背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时加强免疫。
[0035]步骤四：：杂交瘤制备：加强免疫三天后处死小鼠，取脾脏研磨，与小鼠骨髓瘤细胞按10：1比例混合，PEG融合。依次用HAT与HT培养基进行培养，有限稀释法得到单克隆，用间
接ELISA放检测上清OD值，挑选高OD值的单克隆细胞株细胞株，扩大培养。
[0036]步骤五：制备腹水：BalB/C小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，7天后向腹腔注射制备好的杂交瘤。7天待小鼠腹部隆起，抽取小鼠腹水。
[0037]步骤六：抗体纯化：分离小鼠腹水，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。
[0038]抗SIGLEC15单克隆抗体是通过以下步骤鉴定的：将所获得的SIGLEC15抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法用于检测抗原，确认该抗体能够与变性后的天然SIGLEC15蛋白相互作用。
[0039]以下通过特定的具体实例说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株HOO57
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SIGLEC15,其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45151。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株HOO57
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SIGLEC15分泌产生的SIGLEC15单克隆抗体。3.如权利要求2所述的SIGLEC15单克隆抗体在制备用于检测样品中SIGLEC15的制剂中用途。4.一种检测样品中SIGLEC15的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求2所述的SIGLEC15单克隆抗体。5.如权利要求4所述的SIGLEC15单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)提供免疫原：采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽作为免疫原并与载体蛋白交联获得交联免疫原；2)制备杂交瘤细胞：用交联的免疫原免疫动物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树珑，陆文婷，王辉，司国栋，
申请(专利权)人：江苏亲科生物研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：