一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明专利技术所述的分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.45109，本发明专利技术所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。本发明专利技术提供的交瘤细胞株分泌的氟吡呋喃酮单克隆抗体可以用于免疫分析检测，其在氟吡呋喃酮的检测中表现出了较好的检测灵敏度和特异性，IC

A hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against fluorofuranone and its application

【技术实现步骤摘要】
一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫检测
，尤其涉及一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]氟吡呋喃酮(flupyradifurone)是德国拜耳公司开发的一种新型丁烯酸内酯类杀虫剂，可作用于靶标害虫的中枢神经系统，该药剂可高选择性地作用于多种刺吸式口器害虫，速效性好、持效期长，且与常规新烟碱类杀虫剂无交互抗性，其最突出的特点是对蜜蜂等传粉昆虫低毒。
[0003]对于氟吡呋喃酮农药残留的检测，常采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相或液相色谱质谱联用法。但这些方法存在样品前处理复杂和检测时间长等不足，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对氟吡呋喃酮的高效、快速的检测方法。
[0004]酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在兽药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测氟吡呋喃酮的前提是得到对氟吡呋喃酮具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对氟吡呋喃酮具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中样品前处理复杂和检测时间长等问题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的氟吡呋喃酮单克隆抗体对氟吡呋喃酮具有较好的特异性和检测灵敏度(IC
50
值为0.656ng/mL)，可以用于建立氟吡呋喃酮的免疫学检测方法，检测食品中氟吡呋喃酮的残留。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45109，本专利技术所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤，
[0009](1)使用氟吡呋喃酮半抗原制备氟吡呋喃酮完全抗原，将获得的氟吡呋喃酮完全抗原制备成含抗原弗氏完全佐剂与含抗原弗氏不完全佐剂；
[0010](2)对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用步骤(1)中所述含抗原弗氏完全佐剂，加强免疫采用步骤(1)中所述含抗原弗氏不完全佐剂，冲刺免疫采
用步骤(1)中所述氟吡呋喃酮完全抗原；
[0011](3)取步骤(2)中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。
[0012]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(1)中，所述氟吡呋喃酮半抗原结构式如下：
[0013][0014]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(1)中，所述氟吡呋喃酮完全抗原结构式如下：
[0015][0016]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(1)中，所述氟吡呋喃酮完全抗原的制备方法包括如下步骤，将所述氟吡呋喃酮半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于有机溶剂中，反应得到混合液，后将混合液加入到钥孔血蓝蛋白(KLH)溶液中进行反应，得到所述氟吡呋喃酮完全抗原。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，所述有机溶剂为N，N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，所述钥孔血蓝蛋白KLH溶液是经过碳酸盐缓冲溶液CBS稀释得到。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(1)中，所述氟吡呋喃酮完全抗原的制备方法包括如下步骤，将所述氟吡呋喃酮半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于N，N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌进行反应，得到氟吡呋喃酮半抗原溶液；将1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于无水DMF后，加入到氟吡呋喃酮半抗原溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将钥孔血蓝蛋白(KLH)用碳酸盐缓冲溶液(CBS)稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液(PBS)透析反应液，得到氟吡呋喃酮完全抗原。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(2)中，整个免疫过程包括1次首次免疫、3
‑
5次加强免疫和1次冲刺免疫。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(2)中，整个免疫过程中首次免疫与加强免疫之间间隔28
‑
31天，加强免疫之间间隔20
‑
22天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18
‑
21天。
[0022]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(2)中，整个免疫过程中首次免疫的剂量为95
‑
105μg/只，加强免疫的剂量为45
‑
55μg/只，冲刺免疫的剂量为20
‑
30μg/只。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(2)中，所述加强免疫过程中对免疫动物进行采血，通过间接ELISA检测免疫动物血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中氟吡呋喃酮抗体含量高的获得免疫的免疫动物，将筛选出的免疫动物用含抗原弗氏不完全佐剂再进行最后一次加强免疫。
[0024]在本专利技术的一个实施例中，所述采血是在加强免疫过程结束后第6
‑
8天进行。
[0025]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(2)中，所述首次免疫和加强免疫是通过背部皮下注射入免疫动物体内。
[0026]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(2)中，所述冲刺免疫通过腹腔注射入免疫动物体内。
[0027]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(3)中，细胞融合是将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，得到杂交瘤细胞株。
[0028]在本专利技术的一个实施例中，所述培养基为RPMI
‑
1640培养基。
[0029]在本专利技术的一个实施例中，所述亚克隆的次数为2
‑
4次。
[0030]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(3)中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 4000)法进行的。
[0031]在本专利技术的一个实施例中，在步骤(3)中，所述细胞融合是在冲刺免疫结束2
‑
4天后进行。
[0032]在本专利技术的一个实施例中，一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45109，本发明所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。2.一株分泌氟吡呋喃酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)使用氟吡呋喃酮半抗原制备氟吡呋喃酮完全抗原，将获得的氟吡呋喃酮完全抗原制备成含抗原弗氏完全佐剂与含抗原弗氏不完全佐剂；(2)对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用步骤(1)中所述含抗原弗氏完全佐剂，加强免疫采用步骤(1)中所述含抗原弗氏不完全佐剂，冲刺免疫采用步骤(1)中所述氟吡呋喃酮完全抗原；(3)取步骤(2)中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述氟吡呋喃酮半抗原结构式如下：4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述氟吡呋喃酮完全抗原结构式如下：5.根据权利要求2所述的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，路倩倩，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，刘丽强，马伟，朱建平，郝昌龙，宋珊珊，胡拥明，吴爱红，郭玲玲，胥欣欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：