一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用，属于阮病毒检测技术领域。本发明专利技术所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45105。本发明专利技术所述杂交瘤细胞株8D3能高效稳定的分泌单克隆抗体，分泌获得的单克隆抗体特异性好，不仅能特异性识别朊病毒蛋白，还能区分疯牛病和羊痒病病原体。还能区分疯牛病和羊痒病病原体。还能区分疯牛病和羊痒病病原体。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于阮病毒检测
，尤其涉及一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]朊病毒是动物和人类传染性海绵状脑病的病原。由于正常PrP(PrP
c
)转变为致病PrP(PrPSc)，从而引发了一系列神经系统退行性疾病，根据其具有传染性，并根据其共同的神经病理变化，将其命名为“可传播性海绵状脑病”，也称为朊病毒病。朊病毒病的共同特征是均可引起致死性中枢神经系统的慢性退化性疾病，其典型病理学特点包括神经元死亡、空泡样变性、胶质细胞和星状细胞增生、PrPSc(朊病毒的异常形式)蓄积及淀粉样斑块形成，脑部和中枢神经出现很多空洞，呈海绵状改变，病变通常两侧对称。临床症状主要表现为痴呆或知觉过敏、共济失调、震颤等中枢神经症状，如羊痒病、疯牛病。该潜伏期长，数月至数年，甚至数十年不等，但一旦出现临床症状病程将迅速加快，在几周到几个月内死亡，致死率达100％。
[0003]目前，现行欧盟经过评估的TSE诊断方法是同一种方法，是检测脑组织中的PrPsc，既可以用来检测牛，也可以用来检测羊，如果牛脑检测为阳性则判断为疯牛病，如果羊脑检测的为阳性则判断为羊痒病，但不能区分疯牛病和羊痒病。因此，急需一种可用于诊断朊病毒病、并能区分疯牛病和羊痒病病原的单克隆抗体。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种杂交瘤细胞株8D3，能够分泌特异性识别朊病毒蛋白的单克隆抗体，可用于由朊病毒引起的疯牛病羊痒病，并区分疯牛病和羊痒病病原体。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]一种杂交瘤细胞株8D3，所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.45105。
[0007]优选的，所述杂交瘤细胞株8D3以OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株8D3。
[0008]优选的，所述OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物由羊PrP多肽和载体蛋白keyhole limpet hemocyanin偶联而成。
[0009]本专利技术还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株8D3分泌产生。
[0010]优选的，所述单克隆抗体的腹水效价为1:105。
[0011]优选的，所述单克隆抗体特异性识别朊病毒蛋白。
[0012]本专利技术还提供了上述杂交瘤细胞株8D3和/或单克隆抗体在制备检测朊病毒病产品中的应用。
[0013]优选的，所述朊病毒病包括疯牛病和/或羊痒病。
[0014]本专利技术还提供了上述杂交瘤细胞株8D3和/或单克隆抗体在制备区分疯牛病和羊痒病病原体产品中的应用。
[0015]优选的，所述区分疯牛病和羊痒病病原体的方法包括：将感染组织用蛋白酶K处理后，经过电泳、转印，得到单克隆抗体后，进行免疫学检测，该单抗8D3只与痒病PrP
sc
反应，而不与疯牛病PrP
sc
反应。
[0016]本专利技术具有如下有益效果：
[0017]本专利技术杂交瘤细胞株8D3能高效稳定的分泌单克隆抗体，分泌获得的单克隆抗体特异性好，不仅能特异性识别朊病毒蛋白，还能区分疯牛病和羊痒病病原体。
[0018]保藏说明
[0019]本专利技术提供的杂交瘤细胞株8D3(抗养PrP蛋白特异性片段鼠杂交瘤细胞株)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为 2022年3月1日，保藏地址为保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45105。
附图说明
[0020]图1为8D3株单克隆抗体纯化的SDS
‑
PAGE，其中1为低分子量蛋白 Marker，2为纯化腹水(1ul)，3为纯化腹水(2ul)，4为腹水(1ul)，5 为腹水(2ul)；
[0021]图2为杂交瘤细胞8D3培养上清及腹水中单抗ELISA效价的测定曲线；
[0022]图3为8D3株腹水与重组PrP抗原、正常羊脑组织和的western
‑
blot检测结果，其中1为重组PrP，2为蛋白分子量Marker，3为蛋白酶K处理的羊脑组织匀浆，4为羊脑组匀浆，5为羊痒病263K感染仓鼠脑组织；
[0023]图4为不同抗体对蛋白酶K处理后的BSE和Scrapie感染组织的PrPres 带型，左图为单抗6H4反应，右图为单抗8D3反应，其中M为分子量Marker， 1为羊痒病263K感染仓鼠脑组织，2为BSE C57BL感染小鼠脑组织；
[0024]图5为痒病263K感染仓鼠脑组织经过磷钨酸钠沉淀富集后样品经过 1:10，1:20稀释后的蛋白免疫印迹试验结果，其中1、3、5为未经蛋白酶K 处理(Pk
‑
)后1:10稀释，7、9为未经蛋白酶K处理(Pk
‑
)后1:20稀释， 2、4、6为经蛋白酶处理(PK+)1:10稀释，8、10为经蛋白酶处理(PK+) 1:20稀释。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株8D3，所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.45105。所述杂交瘤细胞株 8D3的保藏时间为2022年3月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号，中国科学院微生物研究所。
[0026]在本专利技术中，所述杂交瘤细胞株8D3优选以OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物(多肽序列：GGGGWGQGGSHSQWNK)为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株8D3。
[0027]在本专利技术中，所述OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物优选由羊PrP多肽和载体蛋白keyhole limpet hemocyanin偶联而成。
[0028]在本专利技术中，以OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株的过程中，所述免疫动物优选的为 Balb/c小鼠。本专利技术对于杂交瘤细胞融合技术的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规杂交瘤细胞融合技术均可。
[0029]本专利技术还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株8D3分泌产生。
[0030]本专利技术所述单克隆抗体经Southern Biotech试剂盒鉴定为IgG 2b亚类，轻链为κ链，优选的是用杂交瘤细胞株细胞接种到实验动物腹腔产生腹水而获得，所述实验动物优选为Balb/c小鼠。本专利技术杂交瘤细胞培养血清效价为1:104、腹水效价为1:105。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株8D3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45105。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株8D3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株8D3以OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株8D3。3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株8D3，其特征在于，所述OvPrP(89
‑
104aa)
‑
KLH多肽偶联物由羊PrP多肽和载体蛋白keyhole limpet hemocyanin偶联而成。4.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1
‑
3任一项所述的杂交瘤细胞株8D3分泌产生。5.根据权利要求4所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的腹水效价...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炎鑫，刘全国，史喜菊，徐立伟，侯颖，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：