一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检技术领域。本发明专利技术所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45113，本发明专利技术所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。本发明专利技术提供的交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对除草醚和甲羧除草醚具有较好的特异性(对二苯醚类其他药物交叉率小于1％)和检测灵敏度(IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及食品安全免疫检
，尤其涉及一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]除草醚(Nitrofen)是一种水旱田除草剂，在各种土质、气温条件下均可适用，主要防治某些一年生阔叶及禾本科杂草，可用于白菜、甘蓝、萝卜、油菜、芥菜、水萝卜、茎兰、菜花、芹菜、胡萝卜、香菜、茵香、葛笋、阁蒿、菠菜等以及某些豆科蔬菜等菜田。除草醚作为醚类选择性触杀型除草剂，由于对试验动物具有致畸、致突变、致癌作用，多数国家已禁止生产和使用。
[0003]测定除草醚含量的分析方法目前研究较少，主要有气相色谱
‑
串联质谱法(GC
‑
MS/MS)和高效液相色谱法(HPLC
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UV)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的除草醚检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为除草醚检测提供了一种新的检测途径。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中上述仪器针对除草醚检测的不足。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株分泌的抗体针对除草醚具有较高的检测灵敏度，可以用来建立除草醚的免疫学检测方法。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45113，本专利技术所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤，
[0008]S1、将甲羧除草醚溶于有机溶剂，加入碱性溶液加热至50
‑
80℃回流反应10
‑
14h，得到除草醚半抗原；
[0009]S2、使用S1中所述除草醚半抗原制备除草醚完全抗原，将所得的除草醚完全抗原制备成含抗原弗氏完全佐剂与含抗原弗氏不完全佐剂；
[0010]S3、对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用S2中所述含抗原弗氏完全佐剂，加强免疫采用S2中所述含抗原弗氏不完全佐剂，冲刺免疫采用S2中所述除草醚完全抗原；
[0011]S4、取S3中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所
述抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0012]在本专利技术的一个实施例中，在S1中，还包括用酸性溶液调节pH至酸性，再进行萃取和干燥步骤。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，所述萃取是使用乙酸乙酯萃取三次。
[0014]在本专利技术的一个实施例中，所述酸性溶液为盐酸溶液。
[0015]在本专利技术的一个实施例中，所述干燥是55
‑
65℃旋转蒸馏干燥。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，在S1中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮和N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中的一种或多种。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，在S1中，所述碱性溶液中的碱性溶剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，在S1中，所述除草醚半抗原结构式如下：
[0019][0020]在本专利技术的一个实施例中，在S1中，所述除草醚半抗原的制备方法具体包括如下步骤，取0.5g甲羧除草醚，溶入10mL甲醇氢氧化钠溶液中，65℃加热回流12h，反应结束后加入100mL去离子水，滴加1M HCl溶液调至酸性，乙酸乙酯萃取，合并三次萃取的有机相，60℃旋转蒸馏干燥，得到除草醚半抗原。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，在S2中，所述除草醚完全抗原的制备方法包括如下步骤，将所述除草醚半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺和1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于溶剂中，反应得到混合液，后将混合液加入到载体蛋白溶液中进行反应，得到所述除草醚完全抗原。
[0022]在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)和/或钥孔血蓝蛋白(KLH)。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，所述溶剂为N，N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)。
[0024]在本专利技术的一个实施例中，在S2中，所述除草醚完全抗原的制备方法具体包括如下步骤，将除草醚半抗原溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺，加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌反应3
‑
5h，称为A液；称取载体蛋白，加入缓冲溶液，称为B液；搅拌下，缓慢将A液逐滴加至B液中，室温反应10
‑
14h，得到混合液；透析，即得除草醚完全抗原。
[0025]在本专利技术的一个实施例中，在S2中，所述含抗原弗氏完全佐剂是弗氏完全佐剂与除草醚完全抗原的等体积混合的乳化液。
[0026]在本专利技术的一个实施例中，在S2中，所述含抗原弗氏不完全佐剂是弗氏不完全佐剂与除草醚完全抗原的等体积混合的乳化液。
[0027]在本专利技术的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程包括1次首次免疫、3
‑
5次加强免疫和1次冲刺免疫。
[0028]在本专利技术的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程中首次免疫与加强免疫之间间隔28
‑
31天，加强免疫之间间隔20
‑
22天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18
‑
21天。
[0029]在本专利技术的一个实施例中，在S3中，所述首次免疫和加强免疫是通过背部皮下注射入免疫动物体内；所述冲刺免疫是通过腹腔注射入免疫动物体内。
[0030]在本专利技术的一个实施例中，在S3中，所述加强免疫过程中对免疫动物进行采血，通过间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测血清效价和抑制率，筛选出效价高抑制好的免疫动物。
[0031]在本专利技术的一个实施例中，所述采血是在加强免疫过程结束后第6
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8天进行。
[0032]在本专利技术的一个实施例中，在S4中，细胞融合是将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，得到杂交瘤细胞株。
[0033]在本专利技术的一个实施例中，所述HAT培养基为RPMI
‑
1640培养基。
[0034]在本专利技术的一个实施例中，所述亚克隆的次数为2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45113，本发明所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。2.一株分泌抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，S1、将甲羧除草醚溶于有机溶剂，加入碱性溶液加热至50
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80℃回流反应10
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14h，得到除草醚半抗原；S2、使用S1中所述除草醚半抗原制备除草醚完全抗原，将所得的除草醚完全抗原制备成含抗原弗氏完全佐剂与含抗原弗氏不完全佐剂；S3、对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用S2中所述含抗原弗氏完全佐剂，加强免疫采用S2中所述含抗原弗氏不完全佐剂，冲刺免疫采用S2中所述除草醚完全抗原；S4、取S3中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所述抗除草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在S1中，所述除草醚半抗原结构式如下：4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，王鹏，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，刘丽强，马伟，朱建平，郝昌龙，宋珊珊，吴爱红，郭玲玲，胥欣欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：