一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD及其制备方法与应用，涉及食品安全免疫检测技术领域，该单克隆抗体杂交瘤细胞株的保藏名为单克隆细胞株AD，保藏编号为CGMCC19681。以非那西丁代谢物对乙酰氨基酚与4‑溴丁酸乙酯的反应产物经水解后得到的Phe‑BA为半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原Phe‑BA‑BSA。对小鼠进行免疫原Phe‑BA‑BSA注射免疫后，再通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和五次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体可制成非那西丁检测盒，对非那西丁具有较好亲和力和检测灵敏度，可用于食品中非那西丁残留量的免疫检测。

【技术实现步骤摘要】
一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD及其制备方法与应用
本专利技术属于食品安全免疫检测
，具体涉及一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD及其制备方法与应用。
技术介绍
非那西丁(phenacetin，Phe)属于非淄体抗炎药((NonsteroidalAntiinflammatoryDrugs，NSAIDs)，具有抗炎、止痛、退热等作用，在临床上广泛用于多种发热和各种疼痛症状的缓解。目前NSAIDs是全球使用最多的药物种类之一。全世界大约每天有3000万人在使用。随着NSAIDs使用的增多，这类药物的安全使用问题也越来越受到关注，美国食品药品监督管理局(FDA)认为NSAIDs存在潜在的心血管和消化道出血风险，这使NSAIDs的安全用药成为目前全球医药界的热点问题。尽管广泛的流行病学证据表明滥用非那西汀是肾盂癌的危险因素，但由此引起的肿瘤的基因改变在很大程度上仍不清楚。近年来，因为它有危险的副作用在一些国家已经退出了市场。目前，仍然存在非那西丁用于小动物的解热镇痛。因此，建立快速有效的检测非那西丁含量的方法具有重要意义及市场价值。针对非那西丁的高效灵敏的检测方法是亟待解决的问题。目前的检测方法包括仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法如高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等，由于对样品前处理繁琐，干扰物较多及仪器工作条件的限制，同时对操作人员的技术要求较高，因此仪器方法并不适用于现场检测。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。因此免疫检方法对非那西丁的检测具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种低成本、快速且便携的免疫学检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测出结果。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。对乙酰氨基酚(Paracetamol)，别称泰诺林(Tylenol)、必理通(Panadol)、百服宁(Bufferin)、扑热息痛，是非那西丁的体内代谢产物，通过抑制下丘脑体温调节中枢前列腺素合成酶，减少前列腺素PGE1、缓激肽和组胺等的合成和释放。但是至今尚未有利用酶联免疫法用于非那西丁检测的相关报道。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法与应用，由该细胞株分泌的抗体针对非那西丁具有较高的检测灵敏度，可以用来建立针对非那西丁的免疫学检测方法。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术的一个目的是，提供一株非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名为单克隆细胞株AD，保藏编号为CGMCCNo.19681，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2020年04月23日。本专利技术的另一个目的是，提供一种非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD的制备方法，非那西丁完全抗原免疫小鼠通过细胞融合、HAT选择性培养基培养后，建立得到所述非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD；所述非那西丁完全抗原免疫小鼠是由小鼠经Phe-BA-BSA免疫原免疫所得。进一步的，所述非那西丁完全抗原由Phe-BA半抗原与载体蛋白偶联获得，其中，所述载体蛋白包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)，对应的非那西丁免疫原包括Phe-BA-BSA、Phe-BA-OVA；所述Phe-BA半抗原由对乙酰氨基酚与4-溴丁酸乙酯反应后的产物经水解后得到。4-溴丁酸乙酯是一种常用的农药/医药合成中间体。对乙酰氨基酚与非那西丁结构类似，且具有活性较高的反应位点，能够与4-溴丁酸乙酯以较高的反应率获得半抗原。所述Phe-BA半抗原的结构如下式所示：以Phe-BA-BSA免疫原为例，基本步骤为：(1)免疫原的制备与鉴定：乙酰氨基酚与溴丁酸乙酯的反应产物水解后得到Phe-BA，以所述Phe-BA为半抗原，采用碳二亚胺法将半抗原分别与包括BSA、OVA在内的载体蛋白偶联，制备得到免疫原与包被原，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，分离出的完全抗原就是非那西丁免疫原和包被原，其中，免疫原Phe-BA-BSA用于小鼠免疫制备杂交瘤细胞株，包被原Phe-BA-OVA用于后续的试剂盒检测时使用；(2)小鼠的免疫：使用弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂、Phe-BA-BSA免疫原，通过颈背部皮下注射白变种实验室老鼠即BALB/c小鼠，进行小鼠的免疫，获得非那西丁免疫小鼠。首次免疫(100μg/只)用弗氏完全佐剂与非那西丁免疫原的等体积混合乳化液作为注射剂，数次加强免疫用(50μg/只)弗氏不完全佐剂与非那西丁免疫原的等体积混合乳化液作为注射剂，首次免疫与第一次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天；最后一次用50μL经生理盐水稀释至0.5mg/mL的Phe-BA-BSA免疫原(25μg/只，不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测血清效价和抑制率；数次加强免疫为4～6次，优选为5次；(3)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将非那西丁免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用icELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株AD；(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：抗体亚型的鉴定采用小鼠单克隆抗体免疫胶体金亚型试剂盒方法，IC50值、交叉反应率和亲和力常数采用ELISA法测定。进一步的，所述Phe-BA半抗原的制备方法为，按摩尔比计，将1equ.对乙酰氨基酚溶于二甲亚砜，加入4-6equ.K2CO3，搅拌下加入2-5equ.4-溴丁酸乙酯，加热回流，100℃左右(80～120℃)搅拌，待反应完全，降至室温，浓缩；加入NaOH溶液加热至70～80℃搅拌反应，降至室温，用HCl调节PH至4～5，经萃取、纯化、干燥，得白色固体即为半抗原Phe-BA。本专利技术的另一个目的是，提供一种非那西丁单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC19681的非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株------单克隆细胞株AD分泌产生。本专利技术的另一个目的是，提供上述非那西丁单克隆抗体的应用，用于制备食品安全检测中非那西丁残留量的分析检测用的检测主体，所述检测主体包括试剂、检测板、试剂盒。进一步的，所述检测主体中还包括有非那西丁包被原，所述非那西丁包被原是在Phe-BA半抗原与载体蛋白偶联制备非那西丁免疫原时获得的，其中，所述载体蛋白包括牛血清蛋白BSA、卵清蛋白OVA，对应的非那西丁包被原包括Phe-BA-BSA、Phe-BA-OVA。非那西丁免疫原为Phe-BA-BSA时，对应的非那西丁包被原优选为Phe-BA-OVA，具有更好的特异性和检测灵敏度。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株AD分泌的单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD，其特征在于：已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名为单克隆细胞株AD，保藏编号为CGMCC19681。/n

【技术特征摘要】
1.一种非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD，其特征在于：已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名为单克隆细胞株AD，保藏编号为CGMCC19681。


2.根据权利要求1所述的非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD的制备方法，其特征在于：非那西丁免疫小鼠通过细胞融合、HAT选择性培养基培养后，建立得到所述非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD；所述非那西丁免疫小鼠是由小鼠经非那西丁免疫原免疫所得。


3.根据权利要求2所述的非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD的制备方法，其特征在于：所述非那西丁免疫原由Phe-BA半抗原与载体蛋白偶联获得，其中，所述载体蛋白包括牛血清蛋白BSA、卵清蛋白OVA，对应的非那西丁免疫原包括Phe-BA-BSA、Phe-BA-OVA；所述Phe-BA半抗原由对乙酰氨基酚与4-溴丁酸乙酯反应后的产物经水解后得到，结构如下式所示：





4.根据权利要求3所述的非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD的制备方法，其特征在于：所述Phe-BA半抗原的制备方法为，按摩尔比计，将1equ.对乙酰氨基酚溶于二甲亚砜，加入4-6equ.K2CO3，搅拌下加入2-5equ.4-溴丁酸乙酯，加热回流，80～120℃搅拌，待反应完全，降至室温，浓缩；加入NaOH溶液加热至70～80℃搅拌反应，降至室温，用HCl调节PH至4～5，经萃取、纯化、干燥，得白色固体即为半抗原Phe-BA。


5.根据权利要求2所述的非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株AD的制备方法，其特征在于：所述非那西丁免疫小鼠的免疫方法为，通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠，先用弗氏完全佐剂与非那西丁免疫原的等体积混合乳化液作为注射剂进行首次免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，姚静静，匡华，刘丽强，宋姗姗，吴爱红，徐丽广，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32