一种比较不同蛋白质溶解度的方法技术

本发明专利技术公开了一种比较不同蛋白质溶解度差异的方法，包括：步骤1：提供溶解度降低剂聚乙二醇8000的梯度缓冲液，梯度缓冲液中蛋白质的初始浓度为1mg/ml；步骤2：通过梯度缓冲液中蛋白质浓度的变化情况，确定蛋白质的表观溶解度；步骤3：将不同蛋白质，重复步骤2的操作，得到不同蛋白的表观溶解度之间的差异关系。本方法仅使用少量的蛋白含量，就能快速预测不同蛋白的溶解度关系，有利于在处方筛选前期快速进行分子筛选，从而获得溶解度较高的分子。从而获得溶解度较高的分子。

【技术实现步骤摘要】
一种比较不同蛋白质溶解度的方法


[0001]本专利技术涉及抗体药物制备领域。具体而言，本专利技术涉及一种制剂筛选过程中比较蛋白溶解度的方法，特别是一种使用聚乙二醇8000对蛋白溶解度差异进行比较的方法。

技术介绍

[0002]抗体蛋白质溶解度是生物治疗性药物生产中的关键因素，在皮下高浓度制剂中尤其显著，因此，开发足够高的浓度(＞100mg/mL)的可溶性抗体蛋白质尤其有意义。
[0003]目前有以下几种方法来测定溶解度：超滤浓缩蛋白质溶液，直至观察到出现沉淀或出现其他固体形式，此时对应的浓度即判定为该蛋白对应的最大溶解度；将冷冻干燥的蛋白粉溶解到高浓度溶液中，当出现不溶颗粒时的蛋白浓度即认为是该蛋白对应的最大溶解度。但这些方法都需要大量的蛋白质，当样品量有限，尤其是在生物抗体领域，目标抗体分子获取成本高的情况下，如何通过少量的样品知道各蛋白质之间的溶解度的关系，是本专利技术要解决的问题。
[0004]在低浓度蛋白质溶液中，使用溶解度降低剂(如聚乙二醇)迫使蛋白质沉淀。因为聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法外推溶解度与实验测定的蛋白质溶解度具有很强的相关性，因此本实验采用PEG 8000进行抗体缓冲体系及抗体分子筛选。添加PEG 8000所得到的蛋白质沉淀是无定形的，代表了在给定的PEG 8000溶液条件下单克隆抗体的表观溶解度，表示在限定的含PEG 8000溶液条件下，上清液中蛋白质浓度在0％PEG 8000时的外推蛋白质溶解度，有助于我们对抗体分子进行筛选及最适缓冲体系进行初步判断。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在解决现有技术中，抗体蛋白溶解度测定成本高、样品需求量大的问题，具体来说，解决快速测定抗体蛋白溶解度的技术问题。为此，本专利技术的一个目的在于开发一套操作简便的比较多种抗体蛋白溶解度差异的方法。
[0006]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：
[0007]采用PEG8000进行沉淀预测理论溶解度，对抗体缓冲体系及种类进行筛选，从而获得溶解度最优抗体及缓冲体系。PEG 8000是作为一种水溶性非离子聚合物，利用体积排阻，使蛋白在相应体系中，优于体积排阻相互凝聚从而出现蛋白沉淀析出。先取抗体1进行不同pH缓冲体系筛选(柠檬酸盐pH5.0，组氨酸pH5.5，磷酸盐pH6.0/6.5/7.0)，通过PEG 8000沉淀法得知抗体1在组氨酸(pH 5.5)缓冲体系中理论溶解度最高。接下来，以组氨酸(pH 5.5)缓冲体系对3种抗体进行再研究，从而得到其中理论溶解度最优抗体。最后，采用传统超滤方法对此比较方法进行验证。
[0008]因而，根据本专利技术实施例的一个方面，提供了一种比较不同蛋白质溶解度差异的方法，包括：步骤1：提供溶解度降低剂聚乙二醇8000的梯度缓冲液，梯度缓冲液中蛋白质的初始浓度为1mg/ml；步骤2：通过梯度缓冲液中蛋白质浓度的变化情况，确定蛋白质的表观溶解度；步骤3：将不同蛋白质，重复步骤2的操作，得到不同蛋白的表观溶解度之间的差异
关系。
[0009]根据本专利技术实施例的抗体溶解度差异比较方法，仅使用少量的蛋白含量，便可得到多种蛋白溶解度的差异关系，有利于在生物药物处方筛选前期快速进行分子筛选，从而获得溶解度较高的分子。
[0010]另外，根据本专利技术上述实施例的抗体或抗原结合片段，还可以具有如下附加的技术特征：
[0011]根据本专利技术的实施例，所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述缓冲液为组氨酸缓冲液，pH 5.5。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述聚乙二醇8000的梯度缓冲液，浓度从0％到20％逐渐增加。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述确定蛋白质的表观溶解度，包括：步骤1：选取蛋白质的实际浓度，和聚乙二醇8000含量成近似线性关系的浓度范围；步骤2：计算该范围内，蛋白质的实际浓度的对数，和聚乙二醇8000含量之间的线性函数；步骤3：计算线性函数中，当聚乙二醇8000含量为0时，所得蛋白质浓度。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述蛋白质为抗体。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述抗体为重组全人源抗VEGF单克隆抗体，重组全人源抗TSLP单克隆抗体，和/或重组全人源抗RANKL单克隆抗体。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述抗体为重组全人源抗VEGF单克隆抗体。
[0018]根据本专利技术上述实施例的，专利技术人发现通过PEG沉淀法比较得到的重组全人源抗VEGF单克隆抗体，重组全人源抗TSLP单克隆抗体，和重组全人源抗RANKL单克隆抗体，三种抗体的溶解度大小关系，和超滤测定所得的溶解度大小关系一致，PEG沉淀法预测表观溶解度可以用作参考，有效比较不同抗体溶解度大小关系，有利于在处方筛选前期对抗体分子进行筛选及最适缓冲体系进行初步判断。
[0019]为更好理解本专利技术，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
[0020]术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
[0021]术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
[0022]术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子
5.5)中抗体3理论溶解度。
具体实施方式
[0041]下面将结合实施例对本专利技术的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
[0042]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种比较不同蛋白质溶解度差异的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：提供聚乙二醇8000的梯度缓冲液，所述梯度缓冲液中蛋白质的初始浓度为1mg/ml；步骤2：通过所述梯度缓冲液中蛋白质浓度的变化情况，确定蛋白质的表观溶解度；步骤3：将所述不同蛋白质，重复步骤2的操作，得到不同蛋白的表观溶解度之间的差异关系。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为组氨酸缓冲液，pH 5.5。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇8000的梯度缓冲液，浓度从0％到20％逐渐增加。5.如权利要求1
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4任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：季荣钰，陈坤，梅菲，吴伶俐，竺松，谭小钉，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：