一种IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法技术

本发明专利技术针对IgG2型抗体分子三种二硫键异构体的结构、电荷上的差异，在对各种蛋白分离纯化方法进行反复尝试和结果验证的基础上，最终成功的以CEX

【技术实现步骤摘要】
Vezina，Gregory C.Flynn.
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Structural and Functional Characterization of Disulfide Isoforms Of the Human IgG2 Subclass.
″
)。Jette等利用RP
‑
HPLC分离出IgG2型抗体的IgG2A、IgG2B、IgG2A/B异构体，但组分富集难度较高，且依赖于有机相和较高柱温，抗体发生变性，难以保持异构体生物学活性(Jette Wypych，Ming Li，Amy Guo.
″
Human IgG 2Antibodies Display Disulfide
‑
mediated Structural Isoforms.
″
)。现有技术中的上述方法不仅缺点明显，而且仅能够少量纯化二硫键异构体作为研究，实质上仍属于分析检测方法，难以用于生产实践。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术针对IgG2型抗体分子三种二硫键异构体的结构、电荷上的差异，在对各种蛋白分离纯化方法进行反复尝试和结果验证的基础上，最终成功的以CEX
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HPLC半制备液相色谱实现了对IgG2的二硫键异构体的拆分，进一步结合高分辨率RP
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HPLC色谱和LC
‑
MS鉴定和生物学活性分析，提供了一种保留生物学活性的IgG2型抗体二硫键异构体分离和制备方法。利用CEX
‑
HPLC半制备液相色谱拆分IgG2型抗体二硫键异构体，通过RP
‑
HPLC和LC
‑
MS鉴定和抗原结合能力分析，结果表明本专利技术的方法能够将IgG2型抗体成功拆分为IgG A、IgG B、IgG AB，并且拆分过程中避免了极端物理条件和溶剂体系，有效的保持了IgG2型抗体的生物学活性。
[0008]具体而言：
[0009]一方面，本专利技术提供一种IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，包括：
[0010](1)利用CEX
‑
HPLC半制备液相色谱对IgG2的二硫键异构体进行拆分，收集洗脱峰；
[0011](2)利用液
‑
质串联色谱对步骤(1)中的分离峰进行鉴定，将各分离峰鉴定为IgG A峰、IgG B峰、IgG AB峰、或混合峰；
[0012](3)对IgG A峰、IgG B峰、IgG AB峰、混合峰的生物学活性进行检测鉴定，确定活性最高的IgG2二硫键异构体类型。
[0013]进一步，本专利技术所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(1)利用ProPacTm Elite WCX
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5，5μm，4
×
150mm色谱柱。
[0014]进一步，本专利技术所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(1)按照以下洗脱流程，以0.5ml/min的流速进行线性洗脱
[0015]T(min)％A％B％C070300270300394355240095543095544703006070300
[0016]其中，
[0017]A相：4mmol/L Tris+4mmol/L哌嗪+4mmol/L咪唑，pH 5.0；
[0018]B相：4mmol/L Tris+4mmol/L哌嗪+4mmol/L咪唑，pH 10.5；
[0019]C相：500mmol/L NaCl。
[0020]更进一步，本专利技术所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(1)中采用280nm波长检测器对流出液进行检测，收集洗脱峰。
[0021]进一步，本专利技术所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(2)包括
[0022]A、将三种IgG2型抗体二硫键异构体IgG A、IgG B、IgG AB的IgG2原液，上样RP
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HPLC，收集各级分；
[0023]B、对各级分进行LC
‑
MS质谱鉴定，将各级分鉴定为IgG A、IgG B、或IgG AB；
[0024]C、将步骤(1)收集的各洗脱峰分别上样RP
‑
HPLC装置获得洗脱曲线，根据洗脱曲线上的级分判断步骤(1)收集的各洗脱峰中含有的IgG2型抗体二硫键异构体类型。
[0025]进一步，本专利技术所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(3)包括以二硫键异构体拆分前的IgG2抗体原液为对照，确定IgGA峰、IgG B峰、IgGAB峰、混合峰的相对生物学活性。
[0026]进一步，本专利技术所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于根据IgG2抗体原液的功能，所述生物学活性可包括抗原特异性结合活性、交叉反应活性、信号通路抑制活性、信号通路激活活性等。
[0027]另一方面，本专利技术还提供一种用于对IgG2型抗体二硫键异构体进行拆分和鉴定的系统，其包括
[0028](1)CEX
‑
HPLC半制备液相色谱装置；
[0029](2)RP
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HPLC色谱装置；
[0030](3)LC
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MS质谱装置；
[0031](4)IgG生物活性检测装置。
[0032]另一方面，CEX
‑
HPLC半制备液相色谱在拆分IgG2型抗体二硫键异构体中的应用。
[0033]进一步，本专利技术所述的应用，其特征在于还包括利用RP
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HPLC和LC
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MS液
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质串联色谱对IgG2型抗体二硫键异构体拆分结果进行鉴定。
[0034]为更好理解本专利技术，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
[0035]术语
″
特异性
″
是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
[0036]本文中的术语
″
抗体
″
意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，包括：(1)利用CEX
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HPLC半制备液相色谱对IgG2的二硫键异构体进行拆分，收集洗脱峰；(2)利用RP
‑
HPLC对步骤(1)中的分离峰进行鉴定，将各分离峰鉴定为IgG A峰、IgG B峰、IgG AB峰、或混合峰；(3)对IgG A峰、IgG B峰、IgG AB峰、混合峰的生物学活性进行检测鉴定，确定活性最高的IgG2二硫键异构体类型。2.如权利要求1所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(1)利用ProPacTm Elite WCX
‑
5，5μm，4
×
150mm色谱柱。3.如权利要求2所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(1)按照以下洗脱流程，以0.5ml/min的流速进行线性洗脱T(min)％A％B％C070300270300394355240095543095544703006070300其中，A相：4mmol/L Tris+4mmol/L哌嗪+4mmol/L咪唑，pH 5.0；B相：4mmol/L Tris+4mmol/L哌嗪+4mmol/L咪唑，pH 10.5；C相：500mmol/L NaCl。4.如权利要求2或3所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(1)中采用280nm波长检测器对流出液进行检测，收集洗脱峰。5.如权利要求1所述IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，其特征在于步骤(2)包括A、将三种IgG2型抗体二硫键异构体IgG A、IgG ...

【专利技术属性】
技术研发人员：方鹏，游猛，孙小伟，曹雨霞，王维，朱晓红，冯伟，施磊，岳会亭，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：